Ανάλυση της έκφρασης και κλινική αξιολόγηση μη κωδικών μορίων RNA (ncRNAs) στο πολλαπλό μυέλωμα.

Το πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ) αποτελεί μια ανίατη, βιολογικά ετερογενής ασθένεια των πλασματοκυττάρων. Χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των πλασματοκυττάρων στον μυελό των οστών, η οποία οδηγεί σε υπερπαραγωγή μη λειτουργικών ανοσοσφαιρινών. Ανήκει στην ευρύτερη κατηγορία των πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών και μπορεί να διακριθεί από άλλες μονοκλωνικές γαμμαπάθειες, όπως η μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (MGUS), ή το έρπων πολλαπλό μυέλωμα (sMM), μέσω του συστήματος κατάταξης του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (World Health Organization, WHO). Παράλληλα, συμπεριλαμβάνεται στις αιματολογικές κακοήθειες, και αποτελεί την 2η πιο συχνά εμφανιζόμενη μετά το μη-Hodgkin λέμφωμα. Παρά την αξιοσημείωτη πρόοδο των θεραπευτικών πρωτοκόλλων αντιμετώπισης του πολλαπλού μυελώματος (ΜΜ), τα υψηλά ποσοστά υποτροπής και αντίστασης στη θεραπεία παραμένουν σημαντική πρόκληση για τη βελτίωση διαχείρισης των ασθενών. Στο πλαίσιο αυτό, η ακριβής πρόγνωση της νόσου είναι απαραίτητη για την εξατομικευμένη θεραπεία των ασθενών. Συνεπώς, η ανάγκη εύρεσης βιοδεικτών που θα επιτρέπουν τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση των ασθενών, είναι μονόδρομος. Τα μη κωδικά μόρια RNA (ncRNAs) συνιστούν πιθανούς βιοδείκτες με σημαντική συνεισφορά στην κλινική πράξη. Έτσι, στην παρούσα διπλωματική αποφασίσαμε να ασχοληθούμε με μια νεοσύστατη κατηγορία μη κωδικών μορίων τα οποία έχουν αρχίσει να αναδύονται και να απασχολούν την επιστημονική κοινότητα τα τελευταία χρόνια, τα θραύσματα tRNA (tRFs/t-halves (t-halves ή tiRNAs)). Πρόκειται για τμήματα RNA προερχόμενα από τα πρόδρομα ή ώριμα μόρια tRNA έπειτα από ενζυματική θραύση τους. Παρόλο που στην αρχή είχαν θεωρηθεί ως απόβλητα της αποικοδόμησης των tRNAs, η συγκεκριμένη ομάδα φαίνεται να κατέχει πολύπλοκους βιολογικούς ρόλους και ποικίλες είναι οι μελέτες που δείχνουν την εμπλοκή τους σε διάφορους καρκίνους. Στο πλαίσιο αυτό, κατόπιν εκτενούς αναζήτησης σε βάσεις δεδομένων αλλά και βιβλιογραφικά, επιλέχθηκαν τα εξής μόρια για τη βελτιστοποίηση της μεθοδολογίας ενίσχυσης τους, την αξιολόγηση της έκφρασής τους, καθώς και της κλινικής τους αξίας. Συγκεκριμένα, επιλέξαμε τα 3’tRF-Gly-GCC, 3’tRF-Leu-TAG, mt-i-tRF-His-GTG και το ts46. Παρόλο που έγινε βελτιστοποίηση και για τα 4 μόρια, επιλέχθηκαν τα mt-i-tRF-His-GTG και το ts46, για περαιτέρω μελέτη. Χρησιμοποιήθηκε ένας στατιστικά ικανός αριθμός δειγμάτων (n=89), εκ των οποίων με ΜΜ (n=62), με ασυμπτωματικό πολλαπλό μυέλωμα (sMM) (n=15) και με μονοκλωνική γαμμαπάθεια απροσδιόριστης σημασίας (MGUS) (n=12). Μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν από μυελό των οστών μέσω Ficoll-Paque, ενώ CD138+ πλασματοκύτταρα επιλέχθηκαν με μαγνητικό διαχωρισμό σωματιδίων συνδεδεμένων με ειδικά anti-CD138 mAbs. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA, πολυαδενυλίωση στο 3’-άκρο του και αντίστροφη μεταγραφή με χρήση oligo(dT)-adapter εκκινητή. Τα επίπεδα του i-tRF-HisGTG και του ts46, ποσοτικοποιήθηκαν με in-house qPCR μεθοδολογία. Η ολική επιβίωση (OS), η επιβίωση-ελευθέρας εξέλιξης (PFS) και η επιβίωση σχετιζόμενη με τον καρκίνο, αξιοποιήθηκαν για την ανάλυση επιβίωσης και μετα-θεραπευτικής παρακολούθησης των ασθενών. Τα αποτελέσματα που λάβαμε από την στατιστική ανάλυση ήταν αρκετά ενδιαφέροντα. Τα επίπεδα του mt-i-tRF-His-GTG ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς με ΜΜ, σε σχέση με τους ασθενείς με sMM/MGUS (p=0.042), γεγονός που θα μπορούσε να καθιστά το μόριο μας ως έναν πιθανό διαφοροδιαγνωστικό δείκτη. Παράλληλα, τα χαμηλά επίπεδα του συγκεκριμένου θραύσματος, φαίνεται να σχετίζονται τόσο με την εκδήλωση οστικής νόσου (p=0.045), όσο και με την ύπαρξη κυτταρογενετικών αλλοιώσεων υψηλού κινδύνου (p=0.037). Επίσης, τα επίπεδα του mt-i-tRF-His-GTG, θα μπορούσαν να είναι ένας δείκτης της πρόγνωσης της νόσου. Συγκεκριμένα, τα χαμηλά επίπεδα του συσχετίστηκαν αρνητικά με την ολική επιβίωση (p=0.020) αλλά και τους θανάτους που σχετίζονται με το πολλαπλό μυέλωμα (p=0.011). Η ισχυρή προγνωστική αξία των επιπέδων του mt-i-tRF-His-GTG, όσον αφορούσε την ολική επιβίωση των ασθενών, επιβεβαιώθηκε και από την ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox. Όσον αφορά το ts46, ασθενείς με ΜΜ είχαν χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τους ασθενείς με sMM/MGUS (p=0.01). Επίσης, η ανάλυση επιβίωσης με τις καμπύλες Kaplan-Meier μας υπέδειξε συσχέτιση των χαμηλών επιπέδων του θραύσματος με την ολική επιβίωση των ασθενών (p=0.048), καθώς και με την εξέλιξη της νόσου μετά από κάποιο θεραπευτικό πρωτόκολλο (p=0.032). Η ισχυρή προγνωστική αξία των επιπέδων του ts46, όσον αφορούσε την εξέλιξη της νόσου, επιβεβαιώθηκε και από την ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox. Συμπερασματικά, τόσο το mt-i-tRF-His-GTG, όσο και το ts46, θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως δείκτες διαφοροδιάγνωσης ανάμεσα σε ασθενείς με ΜΜ και ασθενείς με sMM/MGUS, ενώ ταυτόχρονα, τα χαμηλά επίπεδα των δύο θραυσμάτων θα μπορούσαν να είναι δυο δείκτες κακής προγνωστικής αξίας, με τα επίπεδα του mt- i-tRF-His-GTG να αποτελούν και δείκτη κακής έκβασης της νόσου, αφού σχετίζεται με υψηλού κινδύνου αλλοιώσεις και την ύπαρξη οστικής νόσου.Multiple myeloma (MM) is an incurable, biologically heterogeneous disease of plasma cells. It is characterized by uncontrolled proliferation of plasma cells in the bone marrow, which leads to overproduction of non-functional immunoglobulins. It belongs to the broader category of plasma cell dyscrasia and can be distinguished from other monoclonal gammapathies, such as monoclonal gammapathy of undetermined significance (MGUS), or smoldering multiple myeloma (sMM), through the classification system of the World Health Organization (WHO). At the same time, it is included in the haematological malignancies, and is the 2nd most common after non-Hodgkin lymphoma. Despite the remarkable progress of therapeutic protocols for the treatment of multiple myeloma (MM), high rates of recurrence and resistance to treatment remain a major challenge for improving patient management. In this context, an accurate prognosis of the disease is necessary for the individual treatment of patients. Therefore, the need to find biomarkers that will allow the diagnosis, prognosis and monitoring of patients is necessary. Non-coding RNA molecules (ncRNAs) are potential biomarkers with a significant contribution to clinical practice. So, we decided to study a newly established class of non-coding molecules that have begun to emerge and concern the scientific community, tRNA fragments (tRFs/t-halves (t-halves or tiRNAs)). tRNA derivatives constitute a class of small non-coding RNAs, emerging from explicit enzymatic cleavage of the pre- or mature tRNAs, where at first they were considered as waste of the degradation of tRNAs, it seems to possess complex biological roles and various studies show their involvement in various cancers. In this context, after extensive research in databases and bibliographic databases, the following molecules were selected to optimize their amplification methodology, to evaluate their expression, as well as their clinical value. Specifically, we selected the 3'tRF-Gly-GCC, 3'tRF-Leu-TAG, mt-i-tRF-His-GTG and the ts46. Although all 4 molecules were optimized, mt-i-tRF-His-GTG and ts46 were selected for further study. A statistically sufficient number of samples (n=89) were used, of which with MM (n=62), with asymptomatic multiple myeloma (sMM) (n=15) and with monoclonal gammapathy of undetermined significance (MGUS) (n=12). Mononuclear cells were isolated from bone marrow via Ficoll-Paque, while CD138+ plasma cells were selected by magnetic separation of particles bound to specific antiCD138 mAbs. Then, total RNA isolation, polyadelytylation at its 3'-end and reverse transcription using oligo(dT)-adapter was performed. The levels of i-tRF-HisGTG and ts46 were quantified using an in-house qPCR methodology. Overall survival (OS), survival-free progression (PFS) and cancer-related survival (CSS) were used to analyze patient survival and post-therapeutic monitoring. The results we received from the statistical analysis were quite interesting. mt-i-tRF-His-GTG levels were lower in patients with MM, than in patients with sMM/MGUS (p=0.042), thus mt-itRF-His-GTG could represent a novel molecular biomarker able to distinguish between sMM/MGUS and MM patients. At the same time, the low levels of this fragment seem to be related both to the onset of bone disease (p=0.045) and to the existence of high-risk cytogenetic lesions (p=0.037). Also, the levels of mt-i-tRF-HisGTG, could be an indicator of the prognosis of the disease. Specifically, low levels were negatively associated with total survival (p=0.020) and deaths related to multiple myeloma (p=0.011). The strong predictive value of mt-i-tRF-His-GTG levels, in terms of total patient survival, was also confirmed by Cox regression analysis. As regards the ts46, patients with MM had lower levels than patients with sMM/MGUS (p=0.01). Also, the survival analysis with the Kaplan-Meier curves showed us an association of low levels of the fragment with the total survival of patients (p=0.048), as well as with the progression of the disease after a therapeutic protocol (p=0.032). The strong predictive value of ts46 levels, in terms of disease progression, was also confirmed by Cox regression analysis. In conclusion, both mt-i-tRF-His-GTG, and ts46, could be novel molecular biomarkers able to distinguish between sMM/MGUS and MM patients, while at the same time, the low levels of the two fragments could be two indicators of poor prognostic value, with mt-i-tRF-His-GTG levels also being an indicator of poor disease outcome, since it is associated with high-risk lesions and the progression to bone disease

Deregulated expression of IL-37 in patients with bladder urothelial cancer: the diagnostic potential of IL-37e isoform

No abstract available

miRNA-seq identification and clinical validation of CD138+ and circulating miR-25 in treatment response of multiple myeloma

Abstract Background Despite significant advancements in multiple myeloma (MM) therapy, the highly heterogenous treatment response hinders reliable prognosis and tailored therapeutics. Herein, we have studied the clinical utility of miRNAs in ameliorating patients’ management. Methods miRNA-seq was performed in bone marrow CD138+ plasma cells (PCs) of 24 MM and smoldering MM (sMM) patients to analyze miRNAs profile. CD138+ and circulating miR-25 levels were quantified using in house RT-qPCR assays in our screening MM/sMM cohort (CD138+ plasma cells n = 167; subcohort of MM peripheral plasma samples n = 69). Two external datasets (Kryukov et al. cohort n = 149; MMRF CoMMpass study n = 760) served as institutional-independent validation cohorts. Patients’ mortality and disease progression were assessed as clinical endpoints. Internal validation was performed by bootstrap analysis. Clinical benefit was estimated by decision curve analysis. Results miRNA-seq highlighted miR-25 of CD138+ plasma cells to be upregulated in MM vs. sMM, R-ISS II/III vs. R-ISS I, and in progressed compared to progression-free patients. The analysis of our screening cohort highlighted that CD138+ miR-25 levels were correlated with short-term progression (HR = 2.729; p = 0.009) and poor survival (HR = 4.581; p = 0.004) of the patients; which was confirmed by Kryukov et al. cohort (HR = 1.878; p = 0.005) and MMRF CoMMpass study (HR = 1.414; p = 0.039) validation cohorts. Moreover, multivariate miR-25-fitted models contributed to superior risk-stratification and clinical benefit in MM prognostication. Finally, elevated miR-25 circulating levels were correlated with poor survival of MM patients (HR = 5.435; p = 0.021), serving as a potent non-invasive molecular prognostic tool. Conclusions Our study identified miR-25 overexpression as a powerful independent predictor of poor treatment outcome and post-treatment progression, aiding towards modern non-invasive disease prognosis and personalized treatment decisions