Rôle de la Dynamique Membranaire dans la Mise en Place des Mécanismes de Défense chez le Tabac

La cryptogéine, une protéine sécrétée par l oomycète Phytophthora cryptogea, provoque la mise en place de mécanismes de défense chez le tabac, mobilisant au cours des étapes précoces de la signalisation associée, des protéines localisées dans la membrane plasmique (MP). Une fraction membranaire résistante à la solubilisation par les détergents (DIM pour Detergent Insoluble Membrane), enrichie en stérols et en sphingolipides avait été purifiée à partir de la MP de tabac : cette fraction contenait plusieurs protéines impliquées dans la cascade de signalisation induite par la cryptogéine. Chez l animal, l association dynamique de protéines à des microdomaines riches en stérols et sphingolipides en réponse à un stress biotique joue un rôle essentiel dans la régulation de la signalisation cellulaire. L objectif de ce travail était de tester l hypothèse qu un tel phénomène puisse se produire dans notre modèle d étude. La comparaison du protéome de fractions DIMs, purifiées à partir de cellules traitées ou non pendant 5 minutes à la cryptogéine a été réalisée à l aide d un marquage isotopique (15N ou 14N) et d une approche de protéomique quantitative. Le premier résultat est que l abondance de la majorité des protéines n est pas modifiée dans les DIMs en réponse à la cryptogéine. Une seule protéine est enrichie dans les DIMs, une isoforme de 14-3-3, tandis que quatre dynamines (DRPs pour Dynamin Related Proteins), impliquées dans le trafic vésiculaire, sont exclues des DIMs en réponse à la cryptogéine. L étude d une des dynamines identifiées, DRP1A, a été menée. Nous avons caractérisé les différents gènes codant DRP1A dans le génome du tabac, puis utilisé une approche ARN antisens pour altérer l expression de cette protéine et nous avons étudié sa localisation subcellulaire à l aide d anticorps spécifiques et en observant en microscopie confocale cette protéine fusionnée à la GFP. Cette approche a permis de confirmer la présence de DRP1A dans la fraction DIMs et la diminution transitoire de son association à cette fraction en réponse à la cryptogéine, suite à une dissociation de la fraction membranaire. Ces travaux constituent la première mise en évidence d une association/dissociation dynamique de protéines aux DIMs de plantes en réponse à un stimulus biologiqueCryptogein, a protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea, induces defense mechanisms in tobacco. Several proteins involved in the associated signaling pathway were identified and localized on the plasma membrane (PM). A fraction resistant to solubilization by detergent named DIMs for Detergent Insoluble Membranes, enriched in sterols an sphigolipids had been isolated from tobacco PM. It was proved to contain proteins previously identified as actors of the signaling cascade triggered by cryptogein. In animal cells, the dynamic association of proteins to sterol and sphingolipid rich microdomains under the influence of a biological stimulus plays an essential role in the regulation of cellular signaling. The purpose of this work was to test the hypothesis that such a phenomenon might occur in our model. The comparison using isotopic labeling (15N or 14N) and quantitative proteomics, of the composition of DIMs extracted from tobacco cells treated or not by cryptogein, revealed that, although the association to DIMs of most proteins remained unchanged, five proteins had their relative abundance modified after 5 minutes of treatment. One of these was a signaling protein (a 14-3-3 protein) and the four others were related to cell trafficking (4 DRPs, Dynamin Related Proteins). We characterized the DRP1A gene family in tobacco, and set up an antisens RNA antisense to down-regulate the expression of this protein. We studied the intracellular localization of DRP1 using specific antibodies and a GFP fusion. The results confirmed the presence of DRP1 in DIMs and its depletion from this fraction upon cryptogein treatment, through a dissociation from the PM. This is the first evidence of a dynamic association/dissociation of proteins to microdomains in plants upon a biological stimulusDIJON-BU Doc.électronique (212319901) / SudocSudocFranceF

International Conference on Membrane Domains

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Regulation of Plant NADPH Oxidase

The production of Reactive Oxygen Species (ROS) is one of the key events occurring during the response of plants to environmental changes, and contributing to establish adaptive signaling pathways. A plasma membrane bound NADPH oxidase enzyme has been evidenced as the ROS producing system in various plant-microorganisms interactions. We very recently reported, that a protein of the 14-3-3 family was able to interact directly with the C-terminus part of this NADPH oxidase, and that modification of its expression in tobacco cells led to reduced amount of ROS production upon elicitation. In this addendum, we summarize this work, present additional results, and propose an hypothetic model of regulation of this oxidase in a plant defense context

The plasma membrane oxidase NtrbohD is responsible for AOS production in elicited tobacco cells

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Les légumineuses : quand la lentille devient sexy

BAP SPE GEAPSINational audienceLe temps d’un colloque, qui durera deux jours, mardi et mercredi, Dijon deviendra la capitale mondiale des pois chiches et des lentilles. Quelle idée d’organiser les premières Rencontres francophones sur les légumineuses en Côte-d’Or ? D’abord parce que le sujet est un enjeu de santé publique majeur, car les protéines végétales pourraient bien être l’aliment du futur : sain, nourrissant, à moindre coût. Mais aussi parce que notre terre d’élevage et d’agriculture gagnerait à développer ces cultures qui lui assureraient une autonomie. Dernier argument, l’Institut national de la recherche agronomique (Inra), qui organise l’événement, est à la pointe en matière de légumineuses. L’idée de ces rencontres est de réunir 260 personnes, de 16 pays différents. Ensemble, elles étudieront la meilleure façon de promouvoir ces plantes presque miraculeuses, de l’optimisation de la graine, à la dégustation, en passant par la transformation et le packaging. Trois axes seront abordés. D’abord la recherche et du développement : comment maîtriser la sélection des plantes et créer des variétés plus performantes. Puis comment renforcer les atouts des légumineuses dans les cultures. Et enfin, il faudra étudier les débouchés sur les marchés

Rôle de la dynamique de la membrane plasmique dans la mise en place des réactions de défense chez le tabac

National audienceLors des interactions entre les plantes et les microorganismes, des molécules spécifiques élicitent les réponses de défense des cellules végétales. La cryptogéine, une élicitine produite par l’oomycète Phytophtora cryptogea, induit une réponse hypersensible (HR) et une résistance non systémique chez le tabac (1). Aussi bien sur plante entière que sur suspension cellulaire, la reconnaissance au niveau de la membrane plasmique et la fixation de cet éliciteur par un récepteur non identifié déclenche une cascade d’événements au niveau de la membrane plasmique comme un influx rapide de calcium, des efflux d’ions, une alcalinisation extracellulaire. De plus, une NADPH oxydase, NtrbohD responsable de la production transitoire de formes actives de l’oxygène (FAO) est activée (2). L’interaction de l’éliciteur avec la membrane plasmique ainsi que les phénomènes très précoces qui sont liés correspondent aux étapes clés du processus de défense. Chez les cellules animales, lorsque un ligand extracellulaire se lie à son récepteur, le complexe est la plupart du temps internalisé via une endocytose de type RME (Receptor Mediated Endocytosis) par des vésicules mantelées de clathrine. Chez les cellules végétales, les processus d’endocytose sont peu documentés et les interactions ligand-récepteur ne sont pas toujours caractérisées. Récemment, des travaux ont mis en évidence une internalisation ligand-dépendante du récepteur de la flagelline chez Arabidospsis indiquant la place de l’endocytose dans la réponse des plantes aux microorganismes (3). Par l’utilisation d’une sonde fluorescente marqueur de l’endocytose, le FM4-64, nous avons démontré par microscopie laser confocale que les cellules de tabac BY-2 soumises à la cryptogéine augmentent leur vitesse d’endocytose. Par microscopie électronique à transmission nous avons scruté les événements de dynamique membranaire durant l’élicitation et montré une formation de novo transitoire de vésicules à clathrine au niveau de la membrane plasmique. La cinétique de formation de ces vésicules est comparable à celle de l’augmentation transitoire de FAO observée dans les 15 premières minutes après élicitation. Ce fait est confirmé par l’utilisation d’une lignée de tabac BY-2, exprimant l’antisens de l’ADNc NtrbohD, incapable de produire des FAO après élicitation par la cryptogéine. Dans cette lignée, la cryptogéine ne stimule pas l’endocytose indiquant que les FAO sont corrélées à la stimulation de l’endocytose chez le tabac lors de l’élicitation. Une approche d’interférence pharmacologique, récemment utilisée chez Arabidopsis (4) confirme que l’endocytose stimulée par la cryptogéine concerne une voie clathrine-dépendante impliquée dans la RME. Ces travaux apportent une nouvelle vision de dynamique cellulaire à des phénomènes étudiés depuis longtemps sous des angles plus moléculaires. (1) Ricci et al. (1989). European Journal of Biochemistry 183, 555-563. (2) Simon-Plas et al. (2002). Plant Journal 31 (2), 137-147. (3) Robatzek et al. (2007). Cellular Microbiology 9 (1), 1-8. (4) Dhonukshe et al. (2007). Current Biology 17, 520-527

Rôle de la dynamique de la membrane plasmique dans la mise en place des réactions de défense chez le tabac

National audienceLors des interactions entre les plantes et les microorganismes, des molécules spécifiques élicitent les réponses de défense des cellules végétales. La cryptogéine, une élicitine produite par l’oomycète Phytophtora cryptogea, induit une réponse hypersensible (HR) et une résistance non systémique chez le tabac (1). Aussi bien sur plante entière que sur suspension cellulaire, la reconnaissance au niveau de la membrane plasmique et la fixation de cet éliciteur par un récepteur non identifié déclenche une cascade d’événements au niveau de la membrane plasmique comme un influx rapide de calcium, des efflux d’ions, une alcalinisation extracellulaire. De plus, une NADPH oxydase, NtrbohD responsable de la production transitoire de formes actives de l’oxygène (FAO) est activée (2). L’interaction de l’éliciteur avec la membrane plasmique ainsi que les phénomènes très précoces qui sont liés correspondent aux étapes clés du processus de défense. Chez les cellules animales, lorsque un ligand extracellulaire se lie à son récepteur, le complexe est la plupart du temps internalisé via une endocytose de type RME (Receptor Mediated Endocytosis) par des vésicules mantelées de clathrine. Chez les cellules végétales, les processus d’endocytose sont peu documentés et les interactions ligand-récepteur ne sont pas toujours caractérisées. Récemment, des travaux ont mis en évidence une internalisation ligand-dépendante du récepteur de la flagelline chez Arabidospsis indiquant la place de l’endocytose dans la réponse des plantes aux microorganismes (3). Par l’utilisation d’une sonde fluorescente marqueur de l’endocytose, le FM4-64, nous avons démontré par microscopie laser confocale que les cellules de tabac BY-2 soumises à la cryptogéine augmentent leur vitesse d’endocytose. Par microscopie électronique à transmission nous avons scruté les événements de dynamique membranaire durant l’élicitation et montré une formation de novo transitoire de vésicules à clathrine au niveau de la membrane plasmique. La cinétique de formation de ces vésicules est comparable à celle de l’augmentation transitoire de FAO observée dans les 15 premières minutes après élicitation. Ce fait est confirmé par l’utilisation d’une lignée de tabac BY-2, exprimant l’antisens de l’ADNc NtrbohD, incapable de produire des FAO après élicitation par la cryptogéine. Dans cette lignée, la cryptogéine ne stimule pas l’endocytose indiquant que les FAO sont corrélées à la stimulation de l’endocytose chez le tabac lors de l’élicitation. Une approche d’interférence pharmacologique, récemment utilisée chez Arabidopsis (4) confirme que l’endocytose stimulée par la cryptogéine concerne une voie clathrine-dépendante impliquée dans la RME. Ces travaux apportent une nouvelle vision de dynamique cellulaire à des phénomènes étudiés depuis longtemps sous des angles plus moléculaires. (1) Ricci et al. (1989). European Journal of Biochemistry 183, 555-563. (2) Simon-Plas et al. (2002). Plant Journal 31 (2), 137-147. (3) Robatzek et al. (2007). Cellular Microbiology 9 (1), 1-8. (4) Dhonukshe et al. (2007). Current Biology 17, 520-527

Origin of AOS production in tobacco cells elicited by cryptogein

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Cell stage appears critical for control of plasma membrane order in plant cells

International audienceLipids and proteins modulate both the global order of plasma membrane (PM) and its organization in distinct domains. This raises the question of the influence on PM-ordered domain formation of PM composition, which is finely controlled during cell differentiation. Labeling of plant cell PM with an environment-sensitive probe demonstrated that the level of PM order is regulated during anisotropic expansion observed during both cell regeneration from protoplasts and cell differentiation along the growing root. Indeed, PM order progressively decreased during the polarized growth of regenerated tobacco cells, without observed correlation between this parameter and the kinetics of either cell wall regeneration or cell morphology. This suggests that the dynamics of PM formation and renewal could control the PM organization, maybe by involving the secretory pathway

Plasma membrane microdomains in plants: for which physiological roles?

International audienceA large body of evidence supports the existence, in membrane from animal and yeast cells, of functional microdomains playing important roles in protein sorting, signal transduction, or infection by pathogens (1). We demonstrated the presence, in plants, of detergent resistant fractions isolated from plasma membrane, with a lipidic composition similar to animal microdomains (2). Electrophoresis experiments indicated that these fractions were able to recruit a specific set of plasma membrane proteins and exclude others. We used mass spectrometry to give an extensive description of a tobacco plasma membrane microdomains. This led to the identification of 145 proteins whose functional and physico-chemical characteristics were analysed in silico (3). This analysis indicated that if a primary function of the plasma membrane, such as transport, seems under-represented in microdomains, others, such as signalling and response to biotic and abiotic stress, undergo a significant increase of their relative importance. This suggests that these domains are likely to constitute, as in animal cells, signalling platforms involved in particular physiological processes. These results and others recently published (4) lead us to investigate more precisely the putative role played by such microdomains in the early interactions between plants and microorganisms, with a particular attention to reactive oxygen species metabolism. (1) Rajendran & Simons (2005) Journal of Cell Science 118, 1099-1102 (2) Mongrand et al (2004) Journal of Biological Chemistry 279 (35), 36277-36286 (3) Morel et al (2006) Molecular and Cellular Proteomics 5 (8), 1396-1411 (4) Bhat & Panstruga (2005) Planta 223 (1), 5-1