Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung des Abbaus von Propionsäure

In NawaRo-Biogasanlagen (BGA) kann es durch das Angebot an leicht fermentierbaren Kohlenstoff¬quel¬len zu einer bakteriell bedingten Übersäuerung durch unerwünschte kurzkettige Fettsäuren kommen. Häufiger kommt es zur Akkumulation von Propionsäure. Methanogene Archaea können bei niedrigen pH-Werten nicht mehr wachsen. Somit kann der gesamte Prozess der mikrobiellen Bildung von Biogas zum Erliegen kom¬men, was für die Biogasbetreiber zu erheblichen finanziellen Verlusten führt. Das Ziel dieser Disserta¬tion war die Aufklärung der anaeroben bakteriellen Population, die in Biogasanlagen Propionsäure ab¬bauen kann. Aus Propionat entsteht dabei Acetat und Wasserstoff. Da dieser anaerobe Prozess endergon verläuft, kann Propionsäure anaerob nur abgebaut werden, wenn der Wasserstoffpartialdruck niedrig ge¬halten wird. Diese Aufgabe erfüllen in Biogasanalgen methanogene Archaea. Die sog. sekundären Gärer leben somit in synthropher Kultur mit methanogenen Archaea.rnIn dieser Arbeit wurden die Mikroorganismen von Propionsäure-abbauenden Anreicherungskulturen aus vier NawaRo-BGA‘s identifiziert und ihr Substrat- und Produktspektrum analysiert. Die Anreicherungskul¬turen wurden vom Prüf- und Forschungsinstitut e. V. in Pirmasens zur Verfügung gestellt. Durch Analyse der bakteriellen 16S rDNA- Sequenzen der erhaltenen stabilen Propionsäure-abbauenden Mischkulturen wurde gezeigt, dass sich unter den Bakterien hauptsächlich Verwandte von den Clostridiales, aber auch Bacteroides sp., δ-, ε- so¬wie γ-Proteobakterien, Spirochäten, Synergistales und ungewöhnlicher Weise auch Thermotogales befanden. Aus Propionsäure-abbauenden Mischkulturen und aus Fermentern mesophiler NawaRo-Biogasanlagen wurden anaerobe Bakterien und methanogene Archaea angereichert und isoliert. Es wurden aus den Propionsäure-abbauenden Mischkulturen Stämme in Reinkultur erhalten, die entsprechend der 16S rDNA-Analyse als Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 und Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 identifiziert wurden. Sowohl aus Fermentern und Nachgärern von drei NawaRo-BGA‘s als auch aus zwei Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik in Potsdam-Bornim e.V. (ATB) wurden Reinkulturen von methanogenen Archaea erhalten. Diese konnten den Species Methanobacterium formicicum, Metha¬noculleus bourgensis, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosarcina sp., Methanosaeta concilii und Methanomethylovorans sp. zugeordnet werden. Damit wurden in dieser Arbeit unter anderem die typischen bisher nur durch molekularbiologische Methoden identifizierten Species methanogener Ar¬chaea aus unterschiedlichen Fermentern in Reinkultur erhalten. Dabei wurde gezeigt, dass die specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) eine geeignete Methode darstellt, Stämme der gleichen Art methanogener Archaea voneinander zu unterscheiden. Die Methanproduktion der kultivierten methanoge¬nen Archaea wurde gaschromatographisch analysiert. Es zeigte sich, dass die hydrogenotrophe Metha¬nogenese der effizientere und ergiebigere Weg zur Bildung von Methan ist. Mit der Bestimmung der Zellzahl des Isolates Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 bei gleichzeitiger Messung der Methanbildung wurde gezeigt, dass die Methanbildung nicht zwangsläufig mit dem Wachstum korreliert. Ne-ben Pflanzenfasern beinhalteten das hergestellte Reaktorfiltrat in den Kultivierungsansätzen Acetat, die essentielle Aminosäure Valin und den Zuckeralkohol Glycerol. Gezielte Misch¬kul¬turen von sekundären Gärern mit methanogenen Isolaten ergaben einen fördernden Einfluss auf diese Bak¬terien durch hydrogenotrophe Archaea. Diese Bakterien bauten Substrate ab oder bildeten Produkte, die sie unter den gegebenen Bedingungen ohne hydrogenotrophe Archaea nicht umsetzen konnten.Renewable Raw Materials biogas plants can be acidified, because of bacterial formation of volatile fatty acides from easily fermentable carbonsources e. g. propionic acid. Methanogenic Archaea don’t grow at lower pH values. Therefore, the process of bacterial biogas formation is stagnating. This causes financial losses for operators of biogas plants. The objective of this dissertation was to identify the bacterial population, that can degrade propionic acid to acetate and hydrogen in biogas plants. This anaerobic process is an endergonic process and works only with a low partial pressure of hydrogen. This task is performed by methanognic Archaea. These so-called secundary fermenting bacteria are existing in syntrophic culture with methanogenic Archaea.rnIn this task enrichment cultures of propionic acid degrading microorganisms from four Renewable Raw Materials biogas plants were identified and their substrates and products have been analysed. Enrichment cultures were provided by the Prüf- und Forschungsinstitut e. V. in Pirmasens. Stable mixed cultures were analysed by sequencing 16S rDNA. The mixed cultures contained Clostridiales, but also Bacteroides sp., δ-, ε-, γ-Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistales and unusually Thermotogales. From propionic acid degrading mixed cultures and fermenters from biogas plants bacteria and methanogenic Archaea were cultured and isolated. Pure cultures of Clostridium sartagoforme strain Ap1a520 and Proteiniphilum acetatigenes strain Fp1a520 were identified by 16S rDNA analysis. From three fermenters and a secondary fermenter of Renewable Raw Materials biogas plants and additional two laboratory fermenters of the Leibniz-Institute for Agricultural Engineering Potsdam-Bornim (ATB) pure cultures were isolated. The pure cultures were identified as Methanobacterium formicicum, Metha¬noculleus bourgensis, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosarcina sp., Methanosaeta concilii and Methanomethylovorans sp.. So amongst others the typical methanogens were cultured and isolated from different fermenters, which prevously were identified only by molecular biological methods. The specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) were emerged as the appropriate method to distinguish between two different strains of the same species. The formation of methane by methanogenic pure cultures were analysed gaschromatographically. It has shown that the hydrogenotrophic methanogenesis is the more efficient way. Measurements of the methane formation and the determination of the cell number at the same time of isolate Methanoculleus bourgensis strain TAF1.1 showed that the formation of methane does not necessarily correlate. For the use in cultures, self-made reactor filtrate from fermenters contained plant fibres, acetate, the essential amino acid valine and the sugar alcohol glycerol. Defined co-cultures of secondary fermenting bacteria with self-isolated hydrogenotrophic methanogens showed that the methanogens have supported the bacteria. These bacteria fermented substrates or formed products, they were not able to transform in pure culture whithout the hydrogenotrophic methanogenic Archaea under these conditions

Identification of core active site residues of the sulfur oxygenase reductase from Acidianus ambivalens by site-directed mutagenesis.

The sulfur oxygenase reductase (SOR) is the initial enzyme in the sulfur oxidation pathway of Acidianus ambivalens. The SOR is composed of 308 aa residues, three of which are cysteines, and contains a mononuclear non-heme iron site. Mutations of the suspected iron-binding residues H86, H90 and E114 to alanine resulted in inactive enzyme with no iron incorporated, whereas an E114D mutant showed 1% of wild type activity. The mutation of C31 to alanine and serine caused inactivity of the enzyme, however, the iron content was the same as in the wild type. C101A, C104S/A, and C101/104S/A double mutants caused a decrease in specific activity to 10-43% of the wild type while the C101S mutant showed only 1% activity of the wild type. The drop in activity of the C101S and E114D mutants was accompanied with a proportional decrease in iron content. In all cases the oxygenase and reductase partial reactions were equally affected. It was concluded that the Fe site with H86, H90 and E114 as ligands and C31 constitute the core active site whereas C101 and C104 optimize reaction conditions