Pyruvate kinase deficiency protection against malaria : in vitro evaluation of 2,3-Diphosphoglycerate toxicity and plasmodium falciparum susceptibility

Tese de mestrado. Biologia Humana e Ambiente Plasmodium. Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Pyruvate kinase deficiency (PKD) is suggested to be a protective factor against Plasmodium falciparum, but the biological mechanisms are not fully elucidated. However, they may be related to a decrease in the ATP levels and/or to the accumulation of metabolic intermediates such as 2,3-diphosphoglycerate (2,3-DPG), which may also cause increased oxidative stress. Such conditions may cause alterations in the growth/invasion levels of red blood cells (RBCs). So this project aims to unravel if 2,3-DPG could be ultimately used as an antimalarial agent. In this study, 2,3-DPG (sodium salt) was synthesized and its effect examined in infected RBCs with 3D7-chloroquine sensitive and Dd2-chloroquine resistant clones in vitro. The ATP levels were also measured. It was observed a reduction in the invasion levels for both clones, which suggests that 2,3-DPG does play an important role for the protection of PKD against malaria. The IC50 values obtained for each 3D7 and Dd2 clones were 0.98 ± 4.44 mM and 3.9 ± 1.12 mM respectively, which are less than the normal concentration of 2,3-DPG in RBCs. However, this effect might have resulted from the fact that these assays were performed in vitro, in which the behaviour of the compound might be different than in vivo. Overall, with the observed reduction in the ATP levels (more severe in non-infected RBCs), the results suggest an alteration of the RBC’s membrane as a consequence. But there might be other cytotoxic effects of 2,3-DPG, such as increased oxidative stress, that remain to be elucidated. The effect was also studied in hepatocytes to evaluate if 2,3-DPG could be used as an antimalarial agent. The IC50 value was 10.47 ± 1.46 mM for the synthesized form and 6.74 ± 4.48 mM for commercial 2,3-DPG. These values were non-significantly different and higher than the normal concentration of the compound in RBCs.A malária continua a ser a doença parasitária mais importante em regiões tropicais, matando entre um a dois milhões de pessoas por ano. Actualmente, existem cerca de cinco espécies de parasitas que causam a doença nos humanos, mas a maioria das mortes é provocada pelo parasita Plasmodium falciparum. Apesar da sua progressiva eliminação, o aparecimento de resistências aos fármacos tem permitido a reincidência e agravamento da doença. Existem vários factores que contribuem para a variabilidade e complexidade da malária, entre os quais os factores genéticos humanos, capazes de reduzir a susceptibilidade à doença, o que acontece principalmente em regiões endémicas. Entre as variantes polimórficas existentes, as mais frequentes são as hemoglobinopatias e enzimopatias, como a deficiência em G6PD (glucose 6-fosfato desidrogenase). Recentemente, a deficiência em piruvato cinase (PK) foi considerada um factor protector contra a malária em modelos de roedores e humanos, apesar de ainda não ser clara a sua prevalência na população. Neste contexto, os mecanismos de resistência ainda não foram totalmente esclarecidos, mas sabe-se que os distúrbios principais são os baixos níveis de ATP e o aumento de intermediários glicolíticos, como o 2,3-DPG (2,3-difosfoglicerato). No primeiro caso, alterações no ambiente intracelular podem ter implicações na invasão e maturação do parasita, e também na destruição prematura destas hemácias pelos macrófagos. No segundo caso, a acumulação de 2,3-DPG pode inibir enzimas da via glicolítica e da via dos fosfatos de pentose, causando reduzidos níveis de ATP (devido à inibição do hexocinase) e um elevado stress oxidativo (devido à inibição do G6PD). Tudo isto pode influenciar a invasão ou maturação parasitária e aumentar a fagocitose destas hemácias pelos macrófagos. Por isso, este estudo teve como principal objectivo avaliar e quantificar o efeito destrutivo da presença do 2,3-DPG no parasita P. falciparum in vitro (em estirpes sensíveis – 3D7 - e resistentes à cloroquina – Dd2) relativamente à sua viabilidade, invasão e maturação em hemácias na presença e ausência deste composto, visando a possibilidade de o vir a considerar como um potencial fármaco antimalárico. E assim, a toxicidade do 2,3-DPG em células hepáticas humanas, a indução ou não de lise em hemácias parasitadas e não parasitadas e o seu efeito nos níveis de energia (através da medição da quantidade de ATP), também foram estudados no presente projecto. O 2,3-DPG começou por ser sintetizado como sal de sódio (com um rendimento final de 88%) e, posteriormente, o mesmo foi removido para serem ambos testados em ensaios de hepatotoxicidade, juntamente com o 2,3-DPG (sal de sódio) obtido comercialmente (Sigma-Aldrich). Neste ensaio a viabilidade foi avaliada em termos da actividade dos desidrogenases capazes de reduzirem o tetrazólio (MTT) e da disponibilidade energética (ATP). Os valores de IC50 obtidos para o ensaio com o MTT foram: para o 2,3-DPG 8.79 ± 1.52 mM, para o 2,3-DPG (sal de sódio) sintetizado 10.47 ± 1.46 mM e para o comercial 6.74 ± 4.48 mM. Em termos de disponibilidade energética o valor obtido para o 2,3-DPG (sal de sódio) é de 11.40 ± 1.26 mM. Note-se que, estatisticamente, estes valores não são significativamente diferentes entre si, apesar de os mesmos serem significativamente diferentes da concentração normal de 2,3-DPG encontrada em eritrócitos (5 mM). Considerou-se portanto que não havia diferença entre o 2,3-DPG (sal de sódio) sintetizado e o obtido comercialmente. O mesmo passa a ser designado apenas por 2,3-DPG. Para melhor avaliar o efeito do 2,3-DPG nas células hospedeiras do parasita, o mesmo foi testado num ensaio de hemólise. Observou-se que os eritrócitos não lisaram e que houve uma diminuição dos níveis de ATP, o que está correlacionado com a inibição do hexocinase pelo 2,3-DPG. Sendo que esta diminuição pode estar relacionada com alterações na estrutura da membrana, o observado aumento significativo da turbidez do meio pode ser devido a este mesmo factor. Modificações na forma, densidade e nas propriedades das membranas já foram descritas e são uma possível explicação para o sucedido. Os resultados relativos a eritrócitos infectados com ambas as estirpes de P. falciparum na fase anel ajudaram na compreensão dos efeitos do 2,3-DPG. Com tempos de incubação de 24 e de 48 horas, observou-se que os anéis conseguiam maturar até esquizontes no primeiro tempo, ainda que houvesse uma diminuição da parasitémia para ambas as estirpes. No entanto, às 48 horas foi observada uma redução abrupta do número de parasitas na fase anel. Os valores de IC50 calculados, foram de 0.98 ± 4.44 mM para a estirpe 3D7 sensível e de 3.9 ± 1.12 mM para a estirpe Dd2 resistente à cloroquina. Curiosamente, a estirpe Dd2 apresentou alguma resistência ao 2,3-DPG, sem que para já se consigam apontar razões óbvias para tal acontecimento. Ainda assim, é de referir que ambos os valores são inferiores ao valor de referência para a concentração de 2,3-DPG em eritrócitos. É importante referir que in vivo e em eritrócitos não parasitados, o seu papel principal está relacionado com alterações conformacionais na molécula de hemoglobina, provocando a libertação do oxigénio molecular para os tecidos. Já que ensaios in vitro não representam fielmente o que acontece in vivo, sugere-se que o factor responsável pelo sucedido seja a molécula de oxigénio que, in vitro se encontra em baixas concentrações, ao contrário do que acontece in vivo, em que as condições de oxigénio são variáveis. De facto, em modelo de roedor está descrito que eritrócitos infectados apresentam uma maior afinidade para a molécula e menor sensibilidade ao 2,3-DPG, o que é atribuído a modificações químicas da hemoglobina (também devidas à sua digestão pelo parasita). Logo, sugere-se que o efeito do 2,3-DPG in vitro será mais tóxico que in vivo, talvez por estar mais disponível para os seus efeitos inibitórios do que para se ligar à hemoglobina. No entanto, este facto continua por esclarecer. Empiricamente observou-se uma redução dos níveis de invasão de eritrócitos parasitados na presença de 2,3-DPG, o que pode evidenciar a importância desta molécula na protecção conferida pela deficiência em piruvato cinase contra a malária. Relativamente aos níveis de ATP registados nestes ensaios, foi possível observar uma diminuição destes com o aumento da concentração de 2,3-DPG. No entanto, esta foi mais severa com apenas 30 minutos de incubação, o que pode significar que a inibição do hexocinase não é irreversível. Nos três tempos de incubação foram utilizados eritrócitos não parasitados como controlo, onde se observaram níveis de ATP inferiores aos dos eritrócitos parasitados, demonstrando a influência de ambas as estirpes de P. falciparum. No entanto, entre estas não foi observada qualquer diferença significativa. De qualquer modo, a diminuição da concentração de ATP pode ser um dos mecanismos biológicos de acção do 2,3-DPG contra o parasita, para além de possíveis alterações na integridade da membrana do eritrócito. Contudo, está descrito que o 2,3-DPG provoca também um aumento do stresse oxidativo através da inibição do G6PD, o que não foi avaliado neste estudo. Também seria interessante estudar a inibição pelo 2,3-DPG do 5-fosforibosil-1-pirofosfato sintetase, esclarecendo os seus efeitos na via dos fosfatos de pentose. A perspectiva de utilização do 2,3-DPG como fármaco antimalárico mantém-se, tendo em conta os valores de IC50 obtidos nestes ensaios. No entanto, ainda há muito por esclarecer e o menor efeito observado na estirpe não sensível à cloroquina pode representar um risco de desenvolvimento de resistência que continua por explicar. O facto de se terem realizado ensaios apenas in vitro não ilustra aquilo que realmente acontece in vivo, existindo a possibilidade dos resultados serem bastante diferentes, sugerindo-se ensaios em modelo de roedor. Para além disso, seria interessante estudar os níveis de fagocitose de eritrócitos parasitados na presença do composto, já que na deficiência em piruvato cinase, os eritrócitos infectados apresentam níveis mais elevados de fagocitose