Nachweis und Charakterisierung von RANK-Ligand und Osteoprotegerin in humanen Pankreaskarzinomzellen

Zusammenfassung: Die Modulation zellulärer Apoptoseprozesse ist nicht nur essenziell für die normale Zellphysiologie, sondern auch von fundamentaler Bedeutung in der Karzinogenese. Störungen zellulärer Kontrollmechanismen der Apoptose gelten als kritisches Ereignis in der Initiierung und Progression von Tumoren. Eine reduzierte Apoptoserate wird ferner als wichtiger Mechanismus für die Resistenz von Tumorzellen gegenüber einer Radio- und Chemotherapie angesehen. Das duktale Adenokarzinom des Pankreas gehört zu den Tumoren, die weitgehend resistent gegenüber einer konventionellen Chemotherapie sind. Basierend auf den bisherigen Befunden zur Pathogenese des Pankreas-karzinoms und den Vorarbeiten zum Thema RANKL-OPG-System war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Expression und Modulation der OPG-mRNA-Produktion und OPG-Proteinsekretion in humanen Pankreaskarzinomzelllinien zu untersuchen. Als Zellmodelle wurden die Adenokarzinomzelllinien PaTu 8988t, PaTu 8988s, PC-2 und Capan-2 analysiert und der Effekt von Steroidhormonen, Zytokinen und Medikamenten auf die OPG-Expression evaluiert. Die Genexpression wurde mittels Northern Blot und PCR, die Proteinsekretion mittels ELISA bestimmt. Osteoprotegerin (OPG) und Receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) stellen spezifische Rezeptoren und Liganden der TNF-Superfamilie dar, deren Produktion bislang in verschiedenen humanen Geweben nachgewiesen werden konnte. Im Anschluss an den Nachweis von OPG-mRNA im Pankreasgewebe mittels eines kommerziellen Northern Blots konnte OPG auf mRNA- und Proteinebene in zwei der vier untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien (PaTu 8988t und PC-2) nachgewiesen werden. Die PaTu 8988s- und Capan-2-Zellen zeigten dagegen keine Produktion von OPG. Zusätzlich exprimierten PaTu 8988t-Zellen auf mRNA-Ebene RANKL. Für Testosteron ergab sich eine dosis- und zeitabhängige Hemmung der OPG-mRNA- und -Proteinexpression in der Pankreaskarzinomzelllinie PaTu 8988t um 70 bis 77%, während 5α-DHT und 17β-Östradiol keine Effekte hatten. Das adrenale Androgen DHEA hemmte die OPG-Produktion um 83%. In den PC-2- Zellen hingegen senkte das gonadale Androgen 5α-DHT die OPG-Expression. Nach der Exposition der Zelllinie PaTu 8988t durch das Glukokortikoid Dexamethason kam es ebenfalls zu einer dosisabhängigen Hemmung der OPG-mRNA-Spiegel und der OPG-Proteinproduktion um 23%. Aufgrund der wichtigen Rolle von Zytokinen im Rahmen der Tumorimmunologie und der Modulation der Apoptose beim Pankreaskarzinom wurden unterschiedliche Zytokine (IL-1β, TNF-α und IL-8) hinsichtlich ihrer Regulation der OPG-Produktion untersucht. Im Gegensatz zu vielen anderen Zelltypen jedoch hatten diese Zytokine – IL-8 ausgenommen – keinen Einfluss auf die OPG-Expression. Die Behandlung mit IL-8 führte zu einer leichten Steigerung der OPG-mRNA-Produktion in PaTu 8988t-Zellen. Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren Lovastatin und Cerivastatin zeigten in Pankreaskarzinomzelllinien hemmende Effekte auf die OPG-mRNA- und OPG-Proteinexpression. Lovastatin als Statin der ersten Generation senkte die OPG-mRNA- und -Proteinsekretion in PaTu 8988t-Zellen um 90%. Des Weiteren wurden die OPG-mRNA- und -Proteinspiegel durch Cerivastatin in PaTu 8988t-Zellen um 27% und in PC-2-Zellen um 39% gesenkt. Diese Hemmung durch Statine war dosis- und zeitabhängig. Die Hemmung der OPG-Produktion in Pankreaskarzinomzelllinien ist ein weiterer Beleg für die pleiotropen Wirkungen der Statine, die klinisch hinsichtlich ihrer Apoptose modulierenden Effekte auf Pankreaskarzinomzellen genauer untersucht werden sollten. Zusammenfassend weisen die eigenen Ergebnisse in Zusammenschau mit den Arbeiten anderer Gruppen darauf hin, dass das Pankreas sowohl eine Produktionsstätte als auch ein potenzielles Ziel von OPG darstellt, einem wichtigen osteotropen und Apoptose modulierenden Zytokin der TNF-Rezeptorsuperfamilie. Zukünftige Studien sollten die genaue Interaktion von OPG und TRAIL sowie ihre Bedeutung für die Entstehung, Progression und Metastasierung des Pankreaskarzinoms analysieren. Diese Erkenntnisse könnten die Basis künftiger klinischer Studien sein, in denen die gezielte Modulation der Apoptose als therapeutisches Prinzip bei Patienten mit Pankreaskarzinomen eingesetzt werden kann

Nachweis und Charakterisierung von RANK-Ligand und Osteoprotegerin in humanen Pankreaskarzinomzellen

Zusammenfassung: Die Modulation zellulärer Apoptoseprozesse ist nicht nur essenziell für die normale Zellphysiologie, sondern auch von fundamentaler Bedeutung in der Karzinogenese. Störungen zellulärer Kontrollmechanismen der Apoptose gelten als kritisches Ereignis in der Initiierung und Progression von Tumoren. Eine reduzierte Apoptoserate wird ferner als wichtiger Mechanismus für die Resistenz von Tumorzellen gegenüber einer Radio- und Chemotherapie angesehen. Das duktale Adenokarzinom des Pankreas gehört zu den Tumoren, die weitgehend resistent gegenüber einer konventionellen Chemotherapie sind. Basierend auf den bisherigen Befunden zur Pathogenese des Pankreas-karzinoms und den Vorarbeiten zum Thema RANKL-OPG-System war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Expression und Modulation der OPG-mRNA-Produktion und OPG-Proteinsekretion in humanen Pankreaskarzinomzelllinien zu untersuchen. Als Zellmodelle wurden die Adenokarzinomzelllinien PaTu 8988t, PaTu 8988s, PC-2 und Capan-2 analysiert und der Effekt von Steroidhormonen, Zytokinen und Medikamenten auf die OPG-Expression evaluiert. Die Genexpression wurde mittels Northern Blot und PCR, die Proteinsekretion mittels ELISA bestimmt. Osteoprotegerin (OPG) und Receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) stellen spezifische Rezeptoren und Liganden der TNF-Superfamilie dar, deren Produktion bislang in verschiedenen humanen Geweben nachgewiesen werden konnte. Im Anschluss an den Nachweis von OPG-mRNA im Pankreasgewebe mittels eines kommerziellen Northern Blots konnte OPG auf mRNA- und Proteinebene in zwei der vier untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien (PaTu 8988t und PC-2) nachgewiesen werden. Die PaTu 8988s- und Capan-2-Zellen zeigten dagegen keine Produktion von OPG. Zusätzlich exprimierten PaTu 8988t-Zellen auf mRNA-Ebene RANKL. Für Testosteron ergab sich eine dosis- und zeitabhängige Hemmung der OPG-mRNA- und -Proteinexpression in der Pankreaskarzinomzelllinie PaTu 8988t um 70 bis 77%, während 5α-DHT und 17β-Östradiol keine Effekte hatten. Das adrenale Androgen DHEA hemmte die OPG-Produktion um 83%. In den PC-2- Zellen hingegen senkte das gonadale Androgen 5α-DHT die OPG-Expression. Nach der Exposition der Zelllinie PaTu 8988t durch das Glukokortikoid Dexamethason kam es ebenfalls zu einer dosisabhängigen Hemmung der OPG-mRNA-Spiegel und der OPG-Proteinproduktion um 23%. Aufgrund der wichtigen Rolle von Zytokinen im Rahmen der Tumorimmunologie und der Modulation der Apoptose beim Pankreaskarzinom wurden unterschiedliche Zytokine (IL-1β, TNF-α und IL-8) hinsichtlich ihrer Regulation der OPG-Produktion untersucht. Im Gegensatz zu vielen anderen Zelltypen jedoch hatten diese Zytokine – IL-8 ausgenommen – keinen Einfluss auf die OPG-Expression. Die Behandlung mit IL-8 führte zu einer leichten Steigerung der OPG-mRNA-Produktion in PaTu 8988t-Zellen. Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren Lovastatin und Cerivastatin zeigten in Pankreaskarzinomzelllinien hemmende Effekte auf die OPG-mRNA- und OPG-Proteinexpression. Lovastatin als Statin der ersten Generation senkte die OPG-mRNA- und -Proteinsekretion in PaTu 8988t-Zellen um 90%. Des Weiteren wurden die OPG-mRNA- und -Proteinspiegel durch Cerivastatin in PaTu 8988t-Zellen um 27% und in PC-2-Zellen um 39% gesenkt. Diese Hemmung durch Statine war dosis- und zeitabhängig. Die Hemmung der OPG-Produktion in Pankreaskarzinomzelllinien ist ein weiterer Beleg für die pleiotropen Wirkungen der Statine, die klinisch hinsichtlich ihrer Apoptose modulierenden Effekte auf Pankreaskarzinomzellen genauer untersucht werden sollten. Zusammenfassend weisen die eigenen Ergebnisse in Zusammenschau mit den Arbeiten anderer Gruppen darauf hin, dass das Pankreas sowohl eine Produktionsstätte als auch ein potenzielles Ziel von OPG darstellt, einem wichtigen osteotropen und Apoptose modulierenden Zytokin der TNF-Rezeptorsuperfamilie. Zukünftige Studien sollten die genaue Interaktion von OPG und TRAIL sowie ihre Bedeutung für die Entstehung, Progression und Metastasierung des Pankreaskarzinoms analysieren. Diese Erkenntnisse könnten die Basis künftiger klinischer Studien sein, in denen die gezielte Modulation der Apoptose als therapeutisches Prinzip bei Patienten mit Pankreaskarzinomen eingesetzt werden kann