Primera detección en España de necrosis bacteriana de la dipladenia y caracterización fenotípica de su agente causal (Pseudomonas savastanoi)

La dipladenia (género Mandevilla) es una planta nativa de Suramérica con un creciente interés en el sector ornamental, cuyo mercado anual está estimado en 300-400 millones de euros. Las infecciones causadas por Pseudomonas savastanoi, una de las diez especies integrantes del complejo Pseudomonas syringae, suponen una importante amenaza para este mercado. La necrosis bacteriana de la dipladenia, provocada por P. savastanoi, se caracteriza por la aparición de manchas necróticas rodeadas de un halo clorótico en las hojas y el desarrollo de tumores en los tallos. Esta sintomatología se describió por primera vez en Estados Unidos en 2010 y desde entonces se han producido nuevos brotes de la enfermedad en varios países europeos: Alemania (2012), Francia (2012) y Eslovenia (2014). Durante la primavera de 2013 y el otoño de 2014 se detectaron en España plantas de dipladenia con síntomas típicos de la enfermedad, de las que se aislaron varias cepas y posteriormente se identificaron como P. savastanoi mediante análisis multilocus de la secuencia de genes esenciales. Inoculaciones de estos aislados en plantas sanas, seguidas del reaislamiento e identificación, completaron los postulados de Koch, demostrándose que P. savastanoi es el causante de esta enfermedad también en España. Estas cepas de P. savastanoi patógenas en dipladenia (Psd), se han caracterizado junto con una colección de aislados procedentes de todos los países donde se ha descrito la enfermedad. Curiosamente, el perfil LOPAT (Levano, Oxidasa, Pectinolisis, Arginina dihidrolasa, respuesta hipersensible en Tabaco) de todas ellas difiere al de la mayoría de las cepas del complejo P. syringae, dado que Psd no induce la respuesta de hipersensibilidad (HR) en Nicotiana tabacum, aunque codifican un sistema de secreción tipo III funcional. Análisis filogenéticos de los aislados de Psd han revelado la existencia de una relación próxima a cepas de P. savastanoi aisladas de adelfa. Sin embrago, ensayos de patogenicidad cruzada en varios huéspedes de P. savastanoi (olivo, adelfa, fresno y retama), sugieren que Psd podrían constituir un nuevo patovar de esta especie. Finalmente, y utilizando una cepa de Psd marcada con la proteína verde fluorescente, hemos comprobado la migración de patógeno a otras zonas de la planta causando una infección sistémica y, en último término, la marchitez completa de la misma.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Contribution of the metabolism of phenolic compounds to the virulence of Pseudomonas savastanoi in woody hosts

Most strains of the Pseudomonas syringae complex isolated from the trunks of woody plants and belonging to phylogroups (PGs) 1 and 3 share a genomic region, named WHOP (from woody host and Pseudomonas), which is partially conserved in some PG2 strains. Annotation of the 14 ORFs encoded within this region, which is absent in the genomes of P. syringae strains infecting herbaceous hosts, yielded functions possibly involved in the metabolism of phenolic compounds. The genetic organization of this region was analyzed by RT-PCR in Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), the causative agent of olive knot disease. The WHOP region is organized in four operons (antABC, catBCA, ipoABC and dhoAB) and three genes transcribed independently (antR, benR and PSA3335_3206). HPLC analyses confirmed that the antABC and catBCA operons mediate the catabolism of anthranilate and catechol, respectively, through the β-ketoadipate pathway. In addition, oxygenase activity on aromatic compounds, tested as the conversion of indole into indigo, was assigned to the ipoABC operon. Pathogenicity tests revealed that deletion of antABC, catBCA or ipoABC in Psv caused reduced symptoms in woody olive plants, while such phenotype was not observed in young micropropagated (non-woody) plants. Similarly, the catBCA and dhoAB operons and the PSA3335_3206 gene (encoding a putative aerotaxis receptor) are also required for full bacterial fitness exclusively in woody olive plants. At present, we are addressing the role in virulence of the orphan benR gene encoded in the WHOP region.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Evaluation of alternative IAA biosynthetic pathways in the bacteria from the pseudomonas syringae complex

Indole-3-acetic acid (IAA) is a phytohormone belonging to the auxin group which production is widely distributed among plant-associated bacteria. In phytopathogenic bacteria, several IAA biosynthetic pathways have been described. The best characterized is the indole-3-acetamide (IAM) pathway, where tryptophan is initially converted into IAM by a monooxygenase (iaaM gene), and later transformed to IAA in a reaction catalysed by a hydrolase (iaaH gene). Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 (Psv), which synthesizes IAA through IAM, encodes two paralogs of these two genes organized in two operons (iaaMH-1 and iaaMH-2). Previously, we have demonstrated that a Psv mutant in the iaaMH-1 operon produces an amount of IAA significantly lower than that synthesized by the wild type strain. This strain, shows a reduced virulence in olive plants. In contrast, a mutant in the iaaMH-2 operon (which encodes a iaaM-2 pseudogene), produces IAA levels similar to those of the wild type strain and is not affected in virulence. Unexpectedly, the iaaMH-1 mutant and the double mutant iaaMH- 1/iaaMH-2 synthesize a residual amount of IAA, suggesting the existence of an alternative route for the production of this compound in Psv.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Caracterización fenotípica del agente causal de la necrosis bacteria de la dipladenia

La dipladenia (Mandevilla spp.) es una planta ornamental con un amplio mercado en Europa, siendo España e Italia los principales productores. En varios países de Europa (Francia, Alemania, Eslovenia y España) y en Estados Unidos, se ha descrito una enfermedad en dipladenias cuyos síntomas característicos son la aparición de manchas necróticas rodeadas de un halo clorótico en las hojas y el desarrollo de tumores en los tallos. Hemos realizado un análisis filogenético de una colección de aislados de dipladenia procedentes de todos los países en los que se ha descrito esta enfermedad. La filogenia obtenida en base a la secuencia de 4 genes esenciales confirmó que todos los aislados de dipladenia (Psd) pertenecen a la especie Pseudomonas savastanoi. Sin embargo, los Psd presentan un perfil LOPAT (Levano, Oxidasa, Pectinolisis, Arginina dihidrolasa, respuesta hipersensible en Tabaco) diferente al de la mayoría de las cepas de P. savastanoi y Pseudomonas syringae, ya que no inducen la respuesta de hipersensibilidad en Nicotiana tabacum. Además, a diferencia de los aislados de olivo de P. savastanoi, el perfil plasmídico de los Psd es muy similar en todas las cepas. Por otro lado, los Psd presentan en su genoma homólogos a los genes implicados en la biosíntesis del ácido indol-3-acético (IAA) en otras cepas de P. savastanoi. Esta hormona, juega un papel crucial en la patogenidad de aislados de olivo y adelfa. Se ha determinado el número de copias y la localización (plasmídica y/o cromosómica) de los genes iaaM (implicado en la síntesis del IAA) e iaaL (implicado en la conjugación del IAA a lisina). También hemos cuantificado la producción de IAA en los Psd, obteniéndose la mayor producción de la hormona en medio suplementado con triptófano. Además, hemos demostrado que la curación del plásmido que contiene una copia del gen iaaM en uno de los Psd tiene como consecuencia una disminución de la producción de la hormona así como de la virulencia y de la supervivencia de la bacteria en la planta. Ensayos de patogenicidad de varios Psd en los huéspedes previamente descritos de P. savastanoi (olivo, adelfa, fresno y retama), sugieren que las cepas de P. savastanoi aisladas de dipladenia podrían constituir un nuevo patovar. Actualmente estamos analizando la infección sistémica de dipladenia por este patógeno, utilizando para ello un derivado marcado con la proteína verde fluorescente.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Evaluación de rutas alternativas de síntesis de IAA en el complejo Pseudomonas syringae.

El ácido indol-3-acético (IAA) es una fitohormona perteneciente al grupo de las auxinas cuya producción está ampliamente distribuida entre bacterias asociadas a plantas. El IAA está implicado, entre otros procesos, en proliferación celular y maduración de las plantas. Además, se ha descrito el papel de esta hormona en la regulación de la expresión génica en bacterias. En bacterias fitopatógenas, se han descrito varias rutas de síntesis de IAA, siendo la mejor caracterizada la ruta de la indol-3-acetamida (IAM), proveniente del triptófano por la acción de una monooxigenasa (gen iaaM), y transformándose en IAA mediante la acción de una hidrolasa (gen iaaH). Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 (Psv) utiliza esta ruta para la síntesis de IAA, codificando dos parálogos de los genes iaaM e iaaH (operones iaaMH-1 e iaaMH-2). Anteriormente, demostramos que un mutante de Psv en el operón iaaMH-1 produce una cantidad de IAA significativamente inferior que la sintetizada por la cepa silvestre, así como induce una sintomatología reducida en olivo. Por el contrario, un mutante en el operón iaaMH-2 (que codifica un pseudogen iaaM-2), produce una cantidad de IAA similar a la cepa silvestre y no induce una virulencia atenuada. Sin embargo, e inesperadamente, tanto el mutante iaaMH-1 como en el doble mutante iaaMH- 1/iaaMH-2 sintetizan una cantidad residual de IAA, lo que sugiere la existencia de una ruta alternativa para la producción de este compuesto en Psv. Recientemente, hemos identificado otras cepas del complejo Pseudomonas syringae capaces de producir IAA que no codifican genes homólogos a los implicados en las rutas conocidas hasta la fecha. Tras la obtención de los borradores de los genomas de varios aislados pertenecientes a los diferentes patovares de P. savastanoi, y utilizando también otros genomas de cepas modelo incluidas en el complejo P. syringae, hemos llevado a cabo un análisis bioinformático de genes potencialmente implicados en la biosíntesis de IAA. Actualmente, estamos llevando a cabo la construcción de mutantes en algunos de estos genes, para posteriormente determinar su implicación en la biosíntesis de esta fitohormona.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Overproduction of threonine by Saccharomyces cerevisiae mutants resistant to hydroxynorvaline

In this work, we isolated and characterized mutants that overproduce threonine from Saccharomyces cerevisiae. The mutants were selected for resistance to the threonine analog a-amino-13-hydroxynorvalerate (hydroxynorvaline), and, of these, the ones able to excrete threonine to the medium were chosen. The mutant strains produce between 15 and 30 times more threonine than the wild type does, and, to a lesser degree, they also accumulate isoleucine. Genetic and biochemical studies have revealed that the threonine overproduction is, in all cases studied, associated with the presence in the strain of a HOM3 allele coding for a mutant aspartate kinase that is totally or partially insensitive to feedback inhibition by threonine. This enzyme seems, therefore, to be crucial in the regulation of threonine biosynthesis in S. cerevisiae. The results obtained suggest that this strategy could be efficiently applied to the isolation of threonine-overproducing strains of yeasts other than S. cerevisiae, even those used industrially

Dos herramientas bioinformáticas para el análisis de genomas de bacterias fitopatógenas

Comunicación seleccionada como presentación oral plenariaLos avances en tecnología de secuenciación han supuesto una cosiderable reducción en costo y tiempo a la hora de obtener genomas bacterianos completos. Es cada vez más frecuente, pues, secuenciar los genomas de las cepas bacterianas que son de particular interés, creciendo a su vez la necesidad de desarrollar herramientas computacionales para el análisis de las secuencias obtenidas. En lo que a bacterias patógenas se refiere, son de especial relevancia herramientas de detección de genes implicados en virulencia. En este contexto presentamos TTFShunter y ViRfAt, dos aplicaciones bioinformáticas que tienen como objeto facilitar la identificación genómica del arsenal de virulencia de bacterias secuenciadas. TTFShunter (http://bacterial-virulence-factors.cbgp.upm.es/T346Hunter) es una herramienta online de predicción de sistemas de secreción de tipo III, IV y VI (T3SS, T4SS y T6SS, respectivamente). Mediante exhaustivas búsquedas en la bibliografía científica, se construyó una base de datos de las secuencias genómicas correspondientes a los distintos componentes de los T3SS, T4SS y T6SS. Dada la secuencia de ADN de un genoma bacteriano, TTFShunter hace uso de la base de datos anterior para localizar regiones enriquecidas en dichos componentes. ViRfAt es también una aplicación web, en este caso de anotación de factores genómicos asociados a virulencia en planta. ViRfAt busca en genomas bacterianos una batería de factores de virulencia que incluye efectores, fitotoxinas, antibióticos, enzimas extracelulares, hormonas vegetales, adhesinas o sideróforos. Estos factores están incluidos en una base de datos manualmente curada, en cuya elaboración han participado diversos grupos de investigación nacionales expertos en bacterias fitopatógenas. Ambas herramientas presentan una sencilla interfaz web fácil de utilizar, donde una vez analizado el genoma de entrada los resultados se presentan gráficamente a través de un documento HTML intuitivo y fácilmente interpretable. TTFShunter y ViRfAt representan dos herramientas de gran ayuda a microbiológos para la identificación de factores bacterianos de virulencia en planta.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Bioinformatics and transcriptomics analyses of the HrpL regulon in Pseudomonas savastanoi pathovars of woody host.

The species Pseudomonas savastanoi, a member of the Pseudomonas syringae complex, includes four pathovars causing knots or excrescences in woody hosts: P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), pv. fraxini (Psf), pv. nerii (Psn) and pv. retacarpa (Psr), comprising isolates from olive, ash, oleander and broom plants, respectively. One of the better characterized pathogenicity factor in this bacterial complex is the type III secretion system (T3SS) and its effector (T3E) repertoire. Transcription of the T3SS structural genes and most of its T3E genes is positively regulated HrpL. We have constructed ∆hrpL mutants in a model strain belonging to each of this four pathovars and analyzed the role of this gene in the pathogenicity of P. savastanoi. As previously reported for Psv and Psn, the hrpL gene is also necessary in Psf and Psr for both symptoms production during a compatible interaction and the induction of the hypersensitive response in a resistant host. To characterize the HrpL regulon, we are currently following two strategies (i) the bioinformatics identification of HrpL-dependent promoters in the genomes of several P. savastanoi pathovars and, (ii) a comparative RNAseq analysis of a wild-type Psv strain and its ∆hrpL mutant. The results obtained will be compared with those published for other P. syringae strains isolated from herbaceous hosts, in order to identify specific HrpL-dependent proteins involved in the interaction with woody hosts.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Análisis genómico y funcional de los efectores de las familias HopAF y HopAO del sistema de secreción tipo III de Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335

Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv) es el agente causal de la tuberculosis del olivo. El análisis bioinformático del borrador del genoma de Psv NCPPB 3335 permitió identificar 33 posibles efectores (T3E) del sistema de secreción tipo III (T3SS). Además, la secuenciación de los tres plásmidos de esta cepa reveló que los genes codificantes de los T3E HopAF1 y HopAO1 se localizan en los plásmidos pPsv48A y pPsv48B, respectivamente, codificándose en el cromosoma de esta cepa un homólogo de HopAF1 (HopAF1-2). Análisis posteriores revelaron que Psv NCPPB 3335 también codifica en el cromosoma un T3E (HopAO2) que contiene un dominio enzimático tirosina fosfatasa (PTP), similar al que posee HopAO1. El análisis filogenético de las familias HopAF y HopAO permitió identificar que ambas se encuentran ampliamente distribuidas dentro del complejo P. syringae. Análisis de translocación y transcripcionales validaron a los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 como nuevos T3E del secretoma del T3SS de Psv NCPPB 3335. La expresión heteróloga de estos 4 T3E tiene como consecuencia la interferencia con la respuesta de defensa primaria (PTI) de Nicotiana tabacum, lo que implica una reducción de la deposición de calosa y de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Asimismo, los T3E HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 también inhiben la inmunidad mediada por efectores (ETI) en este mismo hospedador. Por otro lado, y utilizando fusiones traduccionales a la proteína verde fluorescente (GFP), se localizaron los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 próximos a la membrana plasmática de las células de Nicotiana benthamiana. Además, HopAO2 también se localizó en vesículas del aparato de Golgi. La deleción del gen hopAF1 del plásmido pPsv48A en Psv NCPPB 3335 tuvo como consecuencia una ligera reducción en el tamaño de los tumores inducidos por este patógeno en plantas de olivo lignificadas, mientras que la deleción del gen hopAO1 conllevó una clara disminución de la virulencia del mismo.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Hacia la identificación del regulón hrpL en Pseudomonas savastanoi

La especie Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye cepas bacterianas aisladas de diversos huéspedes. Hasta la fecha, se han descrito 4 patovares de P. savastanoi capaces de infectar plantas leñosas: pv. savastanoi (aislados de olivo), pv. nerii (aislados de adelfa), pv. fraxini (aislados de fresno) y pv. retacarpa (aislados de retama). Además, recientemente se ha identificado a P. savastanoi como el agente causal de la necrosis bacteriana de la dipladenia (Mandevilla spp.), cuyo rango de huésped es diferente al de los patovares ya establecidos dentro de esta especie (ver comunicación presentada por E. Caballo-Ponce et al.). Con el objetivo de avanzar en el conocimiento de los factores genéticos determinantes del rango de huésped en P. savastanoi, hemos obtenido los borradores de los genomas de varios aislados pertenecientes a los diferentes patovares de esta especie (incluyendo un aislado de dipladenia). Este trabajo se ha centrado en el análisis bioinformático del repertorio de efectores (T3Es) del sistema de secreción tipo III (T3SS) de los diversos aislados secuenciados. Se ha identificado el conjunto de efectores comunes a todos los patovares de P. savastanoi, así como los efectores específicos de cada uno de ellos. Por otro lado, hemos construido mutantes de pérdida de función del gen hrpL en cepas modelo de cada patovar y en el aislado de dipladenia. Este gen, cuya implicación en patogenicidad se ha estudiado ampliamente en aislados de olivo, codifica un regulador positivo de la transcripción de la mayoría de los T3Es y de otros factores de virulencia. Actualmente estamos analizando el papel del gen hrpL en 1) la patogenicidad de todos los aislados seleccionados y, 2) la expresión de varios T3Es seleccionados.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech