Organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis : electrophisiological and molecular features

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014Introdução: As culturas organotípicas podem ser mantidas por longos períodos de incubação através do uso de dois meios de cultura: o meio Optimem, com soro de cavalo, e o meio Neurobasal, suplementado com B27. O soro contém substâncias indefinidas e em quantidades desconhecidas. O meio de cultura Neurobasal, por seu turno, é totalmente definido, o que permite um controlo preciso do ambiente extracelular das culturas. Porém, as propriedades funcionais das células mantidas em meio Neurobasal não são totalmente conhecidas. Além disso, neste meio as fatias desenvolvem atividade epileptiforme espontânea, que se assemelha com a epilepsia in vivo. Objectivo: O objectivo deste estudo é explorar as propriedades celulares e moleculares correlacionadas com a epileptogénese em culturas organotípicas de hipocampo. Metodologia: De forma a explorar os efeitos da remoção do soro nas culturas organotípicas, utilizaram-se duas condições: 1) fatias mantidas num meio com soro, 2) fatias mantidas num meio isento de soro. Avaliou-se a integridade das fatias, a morte celular, e as propriedades funcionais das células. Por fim, de modo a explorar as características correlacionadas com a epilepsia, em fatias mantidas num meio sem soro, avaliou-se a atividade epileptiforme, a ativação dos astrócitos e da microglia, bem como a transcrição das subunidades dos receptores do GABAA e da glicina. Resultados: Observou-se um aumento da excitabilidade das células piramidais de CA1 nas fatias mantidas num meio isento de soro, bem como uma diminuição da eficiência sináptica, sem afectar a integridade das fatias e a morte celular. Estes efeitos, ao longo do período de incubação, aumentam a vulnerabilidade e incidência da atividade epileptiform espontânea, tendo sido observado um progressivo aumento da prevalência da atividade ictal que acompanhou a ativação dos astrócitos e da microglia, bem como a alteração na expressão das subunidades dos receptores GABAA e da glicina. Conclusão: As culturas organotípicas de hipocampo são um modelo útil no estudo da epileptogénese, uma vez que desenvolvem características semelhantes às observadas na epilepsia in vivo.Introduction: Organotypic hippocampal slice cultures can be maintained for long periods of time in vitro using an Optimem horse serum-based medium, which contains unknown quantities of undefined substances, or using a chemically defined Neurobasal medium supplemented with B27. Neurobasal B27-supplemented allows precise control of extracellular environment and avoids the effects of unknown growth factors. However, the functional properties of these cells maintained in this serum-free medium were not yet fully known. Moreover, organotypic slices maintained Neurobasal medium develop spontaneous epileptiform activity that resembles in vivo epilepsy. Aim: The aim of this study is to explore the cellular and molecular correlates of epileptogenesis in organotypic hippocampal slice cultures. Methodology: In order to explore the effects of serum removal, slices were maintained in two different conditions: 1) serum-contain growth medium, 2) serum-free growth medium. Slice integrity, cell death, and functional properties were evaluated. Finally, using serum-free organotypic slice cultures as a model of epileptogenesis, epileptiform activity, astrogliosis and microglia activation, as well as GABAA and glycine receptor transcripts were assessed. Results: Serum removal increased cells excitability and decreased the synaptic efficiency of CA1 hippocampal pyramidal cells, without changing the slice integrity and cell death. These effects, throughout incubation period, lead to increased vulnerability and incidence of spontaneous epileptiform activity. Ictal-like activity becomes progressively more prevalent and overlaps the astrocyte and microglia activation, as well as the changes in GABAAR e GlyR subunits expression. Conclusion: Organotypic hippocampal slice cultures comprise a useful model of epileptogenesis. They develop many features correlated with epilepsy, and can be kept as “in vivo-like” using a defined culture medium