Estudio del efecto de los tratamientos tecnológicos en la desnaturalización de las proteínas alergénicas alimentarias

Las proteínas de la soja son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria por su valor nutricional, así como por sus propiedades tecnológicas y su precio competitivo. Sin embargo, también constituyen una de las principales causas de alergia alimentaria. Los alimentos son sometidos a tratamientos tecnológicos para su higienización, así como para alargar su conservación. Por ello, el efecto que dichos tratamientos tienen en la estructura de las proteínas alergénicas de la soja es de gran relevancia ya que pueden inducir su desnaturalización, y afectar en consecuencia a su capacidad alergénica y/o a su detección. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el efecto de algunos tratamientos tecnológicos en la desnaturalización de las proteínas más abundantes y alergénicas de la soja, la glicinina y la β-conglicinina. Para llevar a cabo este trabajo, las proteínas se purificaron a partir de soja cruda mediante técnicas de precipitación y cromatografía. Las proteínas puras y un extracto proteico de soja se sometieron a tratamiento térmicos, de altas presiones y ultrasonidos. El efecto de estos tratamientos se ha determinado midiendo la inmunorreactividad mediante una técnica de ELISA de tipo sándwich, así como utilizando técnicas de espectroscopía de fluorescencia y electroforéticas. Los tratamientos térmicos y de altas presiones aplicados a la glicinina y la β- conglicinina purificadas producen cambios en su estructura que disminuyen su inmunorreactividad y aumentan su hidrofobicidad. El grado de desnaturalización térmica es menor en la glicinina que en la β-conglicinina en los tratamientos menos intensos pero mayor en los tratamientos más severos. El tratamiento de altas presiones a 400 MPa induce un marcado descenso en la inmunorreactividad de ambas proteínas, que disminuye muy poco a presiones mayores. Sin embargo, los tratamientos de ultrasonidos no parecen afectar sustancialmente a la estructura de la glicinina y la β-conglicinina. El conjunto de los resultados obtenidos indica que tanto los tratamientos térmicos como las altas presiones inducen la desnaturalización de la glicinina y la β-conglicinina y que el grado de desnaturalización depende de la intensidad del tratamiento aplicado, así como del medio del tratamiento y de las características intrínsecas de cada proteína

Obtención de antígenos y anticuerpos para el desarrollo de un test para la detección de crustáceos en alimentos

Los crustáceos se encuentran entre los mariscos más comúnmente consumidos, pero también representan un grupo importante de alimentos que causa alergia alimentaria, siendo la tercera causa más importante de anafilaxia inducida por alimentos. La actual normativa de etiquetado obliga incluir los crustáceos si se utilizan como ingredientes en la elaboración de un alimento. Sin embargo, pueden también estar presentes como alérgenos ocultos debido a una contaminación cruzada durante el procesado, por lo que es necesario disponer de técnicas analíticas específicas y sensibles para su detección. La presente memoria forma parte de un proyecto cuyo objetivo es desarrollar técnicas inmunoquímicas rápidas para la detección de crustáceos en alimentos procesados. Para realizar este trabajo ha sido necesario poner a punto un método de purificación de la tropomiosina, la proteína diana seleccionada por ser abundante y la de mayor potencial alergénico de los crustáceos, además de presentar una elevada termoestabilidad. Estas características son esenciales para que las técnicas que se desarrollen puedan alcanzar una buena sensibilidad y se puedan aplicar en alimentos que hayan sido sometidos a tratamientos térmicos durante su procesado. Se han ensayado diferentes condiciones de preparación de las muestras de langostino (eliminando o no el exoesqueleto, aplicando o no un tratamiento térmico, entre otras), así como diferentes condiciones de extracción (pH y fuerza iónica del tampón, presencia de agentes desnaturalizantes, temperatura y tiempo de incubación, entre otros). Asimismo, se han ensayado dos procesos de purificación, uno mediante técnicas de precipitación isoeléctrica y salina y otro mediante técnicas de cromatografía de filtración en gel). El protocolo de purificación de la tropomiosina con el que se han obtenido los mejores resultados en cuanto a pureza y rendimiento ha incluido la extracción de las proteínas del tejido muscular del langostino con PBS tras un tratamiento en ebullición durante 5 min y la separación de las proteínas mediante una cromatografía de filtración en Sephadex G-50 en presencia de un agente quelante. La tropomiosina purificada se inoculó en conejos para obtener antisueros, que se han caracterizado para conocer su título y especificidad. Los antisueros, analizados mediante una técnica de ELISA indirecto, tienen un título alto y muestran reacción cruzada con extractos de otras especies de crustáceos, tanto crudos como tratados térmicamente, pero no con extractos de moluscos, pescado, carne de ternera o de pollo. Estos resultados indican que los antisueros obtenidos podrían ser usados para desarrollar técnicas inmunoquímicas para la detección de especies de crustáceos en alimentos procesados

Efecto de los tratamientos tecnológicos en la desnaturalización de la proteína alergénica Ara h1 de cacahuete

El cacahuete (Arachis hipogaea) es uno de los principales alimentos que causa alergia alimentaria, ya que representa un 13,1% y un 16,2% del total de alergias alimentarias en niños y en adultos respectivamente. La alergia al cacahuete se caracteriza porque persiste de por vida, a pequeñas dosis desencadena manifestaciones clínicas y con relativa frecuencia da lugar a un shock anafiláctico. Se han descrito hasta 13 proteínas con capacidad alergénica en el cacahuete, siendo las proteínas Ara h1 y Ara h2 las que presentan una mayor tasa de sensibilización entre la población alérgica a ese alimento. Los alimentos son sometidos a tratamientos tecnológicos para su higienización, así como para alargar su conservación y mejorar sus propiedades sensoriales. Por ello, el efecto que dichos tratamientos tienen en la estructura de las proteínas alergénicas de cacahuete es de gran relevancia ya que pueden inducir su desnaturalización, y afectar en consecuencia su capacidad alergénica y su detección. Se han llevado a cabo numerosos estudios para conocer el efecto de los tratamientos térmicos en las proteínas alergénicas del cacahuete. Sin embargo, existe muy poca información del efecto que tienen en ellas las nuevas tecnologías de conservación. El objetivo principal de este trabajo ha sido estudiar el efecto que tienen los tratamientos con altas presiones en la proteína Ara h1 de cacahuete. Para ello, la proteína se ha asilado a partir de cacahuete crudo mediante técnicas de precipitación salina y técnicas cromatográficas, se han obtenido antisueros frente a ella mediante inoculación en conejos y los anticuerpos específicos se han purificado por inmunoadsorción y se han conjugado con el enzima peroxidasa. Utilizando estos reactivos, se han desarrollado diferentes formatos de la técnica de ELISA para la determinación de la proteína Ara h1 resultando el formato de tipo competitivo directo el más adecuado para su cuantificación. El efecto de las altas presiones en la proteína Ara h1 se ha determinado midiendo la pérdida de inmunorreactividad tras someterla a diferentes presiones y tiempos. Las muestras tratadas con altas presiones se han analizado también utilizando técnicas electroforéticas en condiciones nativas y desnaturalizantes. Además, se ha determinado el efecto que tiene la adición de reactivos que modifican los grupos sulfidrilo en la desnaturalización de la proteína Ara h1. La desnaturalización de la proteína Ara h1 por efecto de las altas presiones ha sido muy baja a 200 y 300 MPa. A presiones superiores a 400 MPa, se produce una marcada desnaturalización que tiene lugar en los primeros minutos del tratamiento, obteniéndose una disminución del 47%, 53% y del 70% a los 20 minutos de tratamiento a 400, 500 y 600 MPa, respectivamente. El grado de desnaturalización ha sido similar al tratar la proteína purificada en tampón y en un extracto de cacahuete. Mediante técnicas eletroforéticas, se ha observado que la desnaturalización de la proteína Ara h1 por efecto de la presión da lugar a la formación de agregados mediante enlaces covalentes y no covalentes. La adición del reactivo N-etilmaleimida antes del tratamiento con altas presiones muestra un efecto protector en la desnaturalización de la proteína Ara h1, que parece deberse al bloqueo del grupo sulfidrilo libre de la proteína. Por el contrario, la adición de iodato potásico aumenta su desnaturalización debido probablemente a la oxidación de ese grupo sulfidrilo. La presencia de ambos reactivos previene la agregación de la proteína Ara h1 mediante enlaces covalentes, pero no la que se establece mediante interacciones no covalentes

Desarrollo de una técnica de ELISA en placa, basada en la determinación de las proteínas alergénicas Ara h1 y Ara h2, y su optimización para la detección de cacahuete en chocolate

El cacahuete es un alimento que se consume entero, tostado o frito, o se usa como ingrediente en la elaboración de numerosos alimentos tales como chocolates, turrones, galletas, golosinas, etc. El cacahuete también es el causante de un 15-20% de las alergias alimentarias en los países europeos, que pueden tener consecuencias graves, ya que en un 20% de los casos da lugar a una reacción anafiláctica. El consumidor puede estar expuesto de forma inadvertida a los alérgenos del cacahuete cuando consume alimentos que han sufrido una contaminación cruzada durante su procesado. Por todo ello, es necesario disponer de técnicas específicas y sensibles para su detección en los alimentos. Es un hecho conocido que los taninos y otros polifenoles presentes en el chocolate enmascaran la detección de las proteínas alergénicas del cacahuete al interaccionar con las proteínas diana y/o con los anticuerpos usados en los inmunoensayos. En este trabajo, se ha estudiado el efecto que diferentes bloqueantes tales como leche en polvo, gelatina y polivinilpolipirrolidona, adicionados al medio de extracción en distintas proporciones, tienen en la detección de las proteínas alergénicas del cacahuete en muestras de chocolate. Para ello, previamente se han desarrollado técnicas de ELISA de tipo competitivo indirecto basadas en la determinación de las proteínas alergénicas Ara h1 y Ara h2, que han mostrado ser lineales en un rango de concentración entre 50 ng/ml y 10 µg/ml. Los resultados obtenidos indican que la adición de gelatina y de leche en polvo disminuye las interferencias producidas por el chocolate, obteniéndose los mejores resultados con porcentajes del 5% y del 1%, respectivamente. En esas condiciones, las técnicas de ELISA desarrolladas permiten detectar la adición de un 0,05% de cacahuete en chocolate, obteniéndose mayores diferencias de concentración entre las muestras con un menor contenido de cacahuete y el blanco al usar la gelatina como bloqueante

Desarrollo de técnicas inmunoquímicas para la determinación de proteínas alergénicas de melocotón

En España se estima que un 33% de los individuos alérgicos a alimentos son alérgicos a las frutas. De ellos, el 70% de los casos está asociado al consumo de frutas de la familia de las rosáceas, siendo el melocotón la fruta que con más frecuencia produce alergias. La Pru p3 es la proteína más alergénica del melocotón en los países del sur de Europa, y en nuestro país más del 40% de los individuos alérgicos a esta fruta tienen IgE frente a dicha proteína. La Pru p3 es una proteína básica de 9 KDa que presenta una elevada resistencia al calor y a la proteólisis digestiva, lo que le confiere la capacidad de producir reacciones alérgicas de considerable gravedad. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el efecto que tienen los tratamientos tecnológicos (térmicos y de altas presiones) en la desnaturalización de la Pru p3. Para llevar a cabo este estudio, la proteína se ha aislado a partir de melocotón crudo mediante técnicas cromatográficas y se ha caracterizado mediante electroforesis y espectrometría de masas. La proteína purificada se ha inoculado en conejos para obtener antisueros y con ellos, se ha diseñado una técnica de ELISA de tipo competitivo indirecto para su determinación, que tiene un límite de detección de 1,6 μg/ml. El grado de desnaturalización por efecto de los tratamientos tecnológicos se ha determinado midiendo su inmunorreactividad mediante la técnica desarrollada. Los resultados obtenidos indican que el tratamiento térmico (100 ºC, 10 min) produce un grado de desnaturalización de la Pru p3 mayor al 80%, mientras que los tratamientos de altas presiones (400, 500 y 600 MPa, 15 min) no afectan su estructura. Cuando las muestras tratadas se ensayaron en un ELISA de tipo competitivo indirecto utilizando el suero de individuos alérgicos al melocotón, no se observaron diferencias en la inmunorreactividad de la Pru p3 con las IgE

Estudio de la interaccion de la alfalactalbumina con los acidos grasos: efecto sobre sus propiedades fisicoquimicas y biologicas

En este trabajo se ha estudiado la interacción de la alfa-lactalbúmina humana y bovina, en sus formas nativas y apo, con los ácidos grasos así como el efecto que dicha interacción tiene sobre el crecimiento de células en cultivo. Para ello, la alfa-lactalbúmina se aisló a partir de leche bovina o humana mediante técnicas de ultrafiltración y cromatográficas, utilizando condiciones no desnaturalizantes, con el objeto de mantener la estructura nativa de la proteína. La forma apo de la proteína se obtuvo mediante tratamiento con EDTA y se caracterizó por cromatografía de exclusión molecular, electroforesis, espectroscopia de fluorescencia y dicroísmo circular. Los resultados obtenidos indican que la forma apo presenta una estructura secundaria similar a la forma nativa pero una estructura terciaria alterada con una conformación parcialmente desplegada y una alta tendencia a formar agregados. La interacción de las formas nativas y apo de la alfa-lactalbúmica humana y bovina con los ácidos grasos se ha estudiado utilizando las técnicas de equilibrio de partición y espectroscopia de fluorescencia. Por ambas técnicas y en ambas especies, la forma nativa de la proteína no mostró la capacidad de unir ácidos grasos, mientras que la forma apo sí mostró dicha capacidad. Así, la apo alfa-lactalbúmina de las dos especies tiene un sitio de unión para los ácidos oleico y palmítico, cuyas constantes de asociación aparente han sido del orden de 10-6 M-1 y 10-5 M-1, respectivamente. Por otra parte, se ha estudiado el efecto que tienen diferentes fracciones de la leche y diferentes formas de la alfa-lactalbúmina sobre el crecimiento de las líneas celulares Caco-2 y MDCK. La caseína tiene un efecto letal del 50 % y del 20 % sobre las líneas Caco-2 y MDCK, respectivamente. La fracción de caseína se pasó por una columna de DEAE Seharcryl-M y se eluyó con un gradiente de NaCl. La fracción inhibidora del crecimiento celular eluyó a una concentración de NaCl de 1 M. Esta fracción se caracterizó por diversas técnicas, y resultó ser una mezcla de polímeros de alfa-lactalbúmina. Por el contrario la alfa-lactalbúmina nativa o apo no mostraron ningún efecto letal en ambas líneas. Se ensayó también el efecto que tiene la forma apo de la alfa-lactalbúmina previamente incubada con ácido oleico (relación molar 1/1) sobre el crecimiento celular. Los resultados obtenidos indicaron que la proteína incubada con el ácido graso tenía un efecto letal de aproximadamente un 20 %. Estos resultados indican que para que la alfa-lactalbúmina humana o bovina tenga un efecto letal, es necesaria la desnaturalización parcial de la proteína y la interacción con el ácido oleico

Análisis de proteínas de huevo en alimentos mediante un sistema rápido de lectura imparcial

Las alergias alimentarias constituyen un grave problema de salud pública debido a su alta prevalencia y al deterioro que suponen en la calidad de vida de las personas sensibilizadas. La única forma de prevenirlas es evitando el consumo del alimento alergénico. El control del cumplimiento de la legislación de etiquetado de alérgenos por los organismos competentes y la implementación de un plan de gestión de alérgenos en la industria alimentaria requieren métodos de detección sensibles, rápidos y sencillos.El huevo, muy utilizado por su calidad nutricional y propiedades tecnológicas, es uno de los alimentos más alergénicos. Para detectarlo, la empresa Zeulab ha desarrollado un test inmunocromatográfico, denominado Proteon Egg Express, basado en la detección de ovoalbúmina, la proteína más abundante y alergénica del huevo. El presente trabajo ha tenido como objetivo validar dicho test, siguiendo los protocolos establecidos en las guías internacionales, utilizando un material de referencia, alimentos modelo y comerciales. También se ha probado un lector óptico diseñado para obtener una lectura objetiva de los resultados del test. El test Proteon Egg Express es robusto y tiene una alta sensibilidad, pues permite detectar 1 ppm de huevo en polvo. No ha mostrado interferencias con una amplia gama de ingredientes básicos, por lo que es adecuado para analizar una gran variedad de matrices alimentarias. Su sensibilidad es menor en productos procesados, debido a la desnaturalización térmica de la ovoalbúmina. Se ha determinado la aplicabilidad del test Proteon Egg Express a superficies de trabajo, donde puede detectar 0,5 y 0,25 µg de huevo en polvo en acero inoxidable y melamina, respectivamente. En aguas de limpieza, es capaz de detectar 1 ppm de huevo en polvo en presencia de concentraciones de 0,5 N y 0,1 N de hidróxido sódico y de ácido clorhídrico, respectivamente. <br /

Comparación de las leches hipoalergénicas destinadas a la alimentación de niños con alergia a las proteínas de leche de vaca.

Las fórmulas infantiles son productos alimenticios destinados a la alimentación de los lactantes en los primeros años de vida. Dentro de este contexto, se encuentran las fórmulas hipoalergénicas, diseñadas para la alimentación de lactantes que no pueden ser amamantados y que presentan alergia a las proteínas de leche de vaca (APLV). Actualmente existen fórmulas constituidas por diferentes fuentes proteicas, desde la misma leche de vaca hasta fórmulas vegetales. Este Trabajo de Fin de Grado tiene como objetivo recopilar y analizar información sobre las propiedades de las distintas fórmulas infantiles hipoalergénicas y su efecto en los lactantes. Para conseguir este objetivo, se ha realizado una búsqueda bibliográfica sistematizada en las bases de datos IBECS, MEDLINE, The Cochrane Library y Google Académico utilizando diferentes estrategias de búsqueda. Se han revisado un total de 60 estudios que cumplieron los criterios de inclusión, de los cuales 23 han sido incluidos. Los resultados de estos estudios han mostrado las fortalezas y limitaciones de las diferentes fórmulas en la población infantil con APLV. Se ha indicado que las leches de vaca hidrolizadas, en concreto las altamente hidrolizadas, son consideradas como las más adecuadas para niños con síntomas de APLV. Las leches elementales serían la opción en caso de que las anteriores no resulten eficaces, dado que no dan ningún tipo de reacción en el niño. Sin embargo, presentan un sabor desagradable y su coste es superior al de las leches hidrolizadas. El uso de leches elaboradas a partir de proteínas vegetales, procedentes de la soja o el arroz, está recomendado para lactantes cuyos padres son vegetarianos, o en niños intolerantes a la lactosa. En el resto de niños, constituyen una alternativa en los casos de APLV, recomendándose únicamente a partir de los seis meses de edad debido a los compuestos que tienen estas fórmulas (fitatos, fitoestrógenos, etc.). La búsqueda llevada a cabo manifiesta la necesidad de realizar más estudios con todas las opciones de alimentación disponibles para niños con APLV, que incluyan las diferentes fórmulas hipoalergénicas, con el fin de conocer los beneficios que aportan y realizar unas recomendaciones específicas de uso en función de las necesidades de cada caso

Estudio mediante técnicas inmunoquímicas del efecto del procesado en algunas proteínas alergénicas y recombinantes de los alimentos

Las técnicas inmunoquímicas son muy usadas actualmente en el control de calidad en la industria alimentaria, al presentar una alta sensibilidad y especificidad, además de ser sencillas, rápidas y de bajo coste. Sin embargo, hay que considerar que, en el análisis de alimentos procesados, los tratamientos tecnológicos pueden alterar la solubilidad de la proteína diana, dificultando su extracción o desnaturalizarla, destruyendo epítopos que son reconocidos por sus anticuerpos específicos. En esta tesis, se ha estudiado el efecto que los tratamientos tecnológicos, fundamentalmente los térmicos, tienen sobre la determinación de algunas proteínas alergénicas, la &#946;–lactoglobulina de la leche y el ovomucoide del huevo, y de la proteína recombinante Cry1A(b) del maíz transgénico, para controlar la fiabilidad de los sistemas de detección basados en técnicas inmunoquímicas. Además, se ha estudiado el efecto de la pepsina en la degradación de la proteína Cry1A(b), estudio que es importante para evaluar su potencial alergenicidad

Estudio de las proteínas de la membrana del glóbulo graso de leche de vaca y oveja

Las proteínas de la membrana del glóbulo graso representan del 25 al 70% del total de sus componentes. Se han descrito alrededor de 40 proteínas diferentes con pesos moleculares de entre 15 y 240 KDa, las cuales ejercen importantes funciones biológicas. La localización de estas proteínas en la membrana del glóbulo graso es diferente, pueden ser integrales, periféricas o bien establecer una interacción débil con la membrana, lo que condiciona la forma de obtenerlas. En general se trata de proteínas difíciles de aislar por su alto grado de hidrofobicidad y su baja concentración. En este trabajo se ha realizado una caracterización electroforética de las proteínas presentes en el suero de mantequilla (buttermilk) y en el suero obtenido de la fusión de la mantequilla (butterserum) de leche de vaca y oveja, así como en los buttermilk comerciales. Para ello las electroforesis realizadas con SDS se tiñeron con tres técnicas: Azul de Coomassie, nitrato de plata y un reactivo específico para glicoproteínas. Además, se llevaron a cabo los procedimientos descritos por otros autores para el aislamiento de la butirofilina y de la parte extracelular de la mucina-1. En el caso de la butirofilina, tras la obtención de una fracción rica en membranas del glóbulo graso se sometió a una cromatografía de afinidad con Concanavalina-A, en la que nuestra proteína de interés quedó retenida, para ser recuperada posteriormente en una elución con α-metil-manósido. Para el aislamiento de la parte extracelular de la mucina-1, se obtuvo una fracción enriquecida en membranas del glóbulo graso que se incubó con tripsina para liberar dicha parte externa a la membrana de 32 KDa. Finalmente se sometió a una cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sephadex en la que el fragmento quedó retenido y se eluyó con un gradiente de cloruro sódico. El presente trabajo fin de máster se engloba dentro de un proyecto cuyo objetivo es caracterizar las proteínas de la membrana del glóbulo graso con actividad defensiva, procedentes tanto de leche de vaca y oveja como de productos comerciales de mazada, y estudiar el efecto de los tratamientos tecnológicos sobre su integridad y actividad para su utilización en alimentos funcionales