Untersuchungen zur epigenetischen Regulation der Arzneimittelresistenzgene MGMT, ABCB1 und ABCG2 in der Tumorentität Glioblastoma multiforme

Das Glioblastoma multiforme stellt den häufigsten primären Gehirntumor Erwachsener dar, der mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten nach Diagnosestellung und einer 5-Jahresüberlebensrate von weniger als 5% einhergeht. Um in der Zukunft personalisierte Therapieverfahren für das Glioblastoma multiforme entwickeln und auf diese Weise das Überleben der Patienten verlängern zu können, wird nach relevanten molekularen Faktoren für die Malignität des Glioblastoma multiforme gesucht. Die DNA-Methylierung stellt einen bekannten Mechanismus für die epigenetische Modulation der Genexpression dar und spielt eine entscheidende Rolle in der Dysregulation von Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen während der Krebsentwicklung. Die Promotormethylierung des für das DNA-Reparaturenzym MGMT kodierenden Genes sowie die Arzneimitteltransporter ABCB1 und ABCG2 werden als Auslöser der Chemoresistenz des Glioblastoma multiforme diskutiert. Um die Promotormethylierung der Gene MGMT, ABCB1 und ABCG2 zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit Pyrosequencing-Assays für die Methylierungsmessung der Genpromotoren von MGMT, ABCB1 und ABCG2 sorgfältig etabliert. Dabei wurde die Methode des Pyrosequencing zur Detektion der Methylierung gewählt, da diese eine exakte Quantifizierung des Methylierungsgehalts erlaubt. Die Ergebnisse der verwendeten Assays erwiesen sich als sehr valide und reliabel. Darüber hinaus wurde mittels Real Time-PCR die MGMT-, ABCB1- und ABCG2-Expression in den Glioblastomproben bestimmt. Da in der Fachliteratur Auswirkungen der Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) MGMT C-56T, ABCB1 C3435T und ABCG2 C421A auf die Expression und Funktion der in die Untersuchungen eingegangenen Gene beschrieben worden sind, wurden diese SNPs ebenfalls in den Glioblastomproben bestimmt und zu den Methylierungsdaten in Beziehung gesetzt. Durch die statistische Auswertung der erhobenen Promotormethylierungs- und Expressions- sowie SNP-Ergebnisse ergaben sich eine signifikant negative Korrelation zwischen MGMT-Methylierung und -Expression in den Glioblastomproben sowie ein signifikanter Zusammenhang zwischen der MGMT-Methylierung und dem MGMT C-56T-Polymorphismus. Hinsichtlich der klinischen Daten der Glioblastompatienten konnte mittels bivariater und multivariater Cox-Analysen kein signifikanter Einfluss von MGMT-, ABCB1- und ABCG2-Promotormethylierung auf das Gesamtüberleben von Glioblastompatienten in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden. Daneben war kein signifikanter Einfluss des Alters der Patienten bei Diagnosestellung sowie des Geschlechts auf die Promotormethylierung der Gene MGMT, ABCB1 und ABCG2 nachweisbar. Insgesamt kann geschlussfolgert werden, dass die MGMT-, ABCB1- und ABCG2-Promotormethylierung keine prognostische Relevanz für Glioblastompatienten besitzen und die Suche nach anderen molekularen Zielstrukturen in Glioblastomen, die möglicherweise eine prognostische Aussage oder die Grundlage für eine Therapieoptimierung für Patienten mit einem Glioblastom erbringen könnten, zu erwägen ist.Glioblastoma multiforme is the most common primary brain tumor in adults with an overall survival of 12-15 months after diagnosis and a 5 years survival rate of less than 5%. To develop personalized therapies for Glioblastoma multiforme in the future and thus to prolong the overall survival of patients research groups are looking for relevant molecular factors for the malignancy of Glioblastoma multiforme. The DNA methylation is known as mechanism of epigenetic modulation of gene expression and plays a pivotal role in the dysregulation of proto-oncogenes and tumorsuppressor genes during the development of cancer. The promoter methylation gene MGMT coding for a DNA reparation enzyme and ABCB1 and ABCG2 coding for drug transporter are seen as cause for chemoresistance in Glioblastoma multiforme. To investigate the promoter methylation of MGMT, ABCB1 and ABCG2 pyrosequencing assays have been established and used. Pyrosequencing assays have been used, because they are able to give an exact quantification of the methylation level. The results of these assays have been valid and reliable. Furthermore, Real Time PCR assays have been made to measure the MGMT, ABCB1 and ABCG2 expression in the Glioblastoma samples. Because effects of the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) MGMT C-56T, ABCB1 C3435T and ABCG2 C421A on expression and function of the genes have been described in the literature, these SNPs have been measured in the Glioblastoma samples and have been correlated to the methylation results. In this thesis a significant negative correlation between MGMT methylation and expression and a significant correlation between MGMT methylation and MGMT C-56T SNP have been shown. Regarding the clinical data of the patients, no significant connection of MGMT, ABCB1 and ABCG2 methylation with overall survival of the patients have been shown in bivariate as well as in multivariate Cox analyses. Furthermore, no significant effect of age at diagnosis and gender on the promoter methylation of the genes have been shown. In conclusion, MGMT, ABCB1 and ABCG2 promoter methylation do not have a prognostic relevance for Glioblastoma patients and the search for further molecular targets in Glioblastoma, which have prognostic relevance and may be the basis for a targeted therapy, is still needed

Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung des Transkriptionsfaktors MEF für die stammzellvermittelte Genese des Glioblastoma multiforme

Trotz multimodaler Behandlungschemata bestehend aus Resektion, Chemotherapie und Radiatio stellt das Glioblastoma multiforme nach wie vor eine große Herausforderung auf onkologischem Gebiet dar. Dieser hochmaligne Hirntumor ist durch eine hohe zelluläre Proliferationsrate, diffuse Infiltration, Anwesenheit von Nekrosen, Angiogenese, mikrovaskuläre Hyperplasie, Apoptoseresistenz und genomische Instabilität charakterisiert. Aufgrund der Invasivität und Rezidivierung beträgt das mediane Gesamtüberleben der Patienten mit einem Glioblastom nur 15 Monate, so dass eine intensive Erforschung neuer Therapiestrategien zwingend erforderlich ist. Eine onkogene Funktion des Transkriptionsfaktors MEF (Myeloid ELF-1-like Factor) ist bereits für andere Tumorentitäten wie Ovarialkarzinome und akute myeloische Leukämie beschrieben. Seine Wirkung vermittelt MEF in diesen Tumoren sowohl über eine Inhibition des p53-Signalwegs als auch p53-unabhängig. In Gehirntumoren ist bislang die Bedeutung der Expression und Funktion von MEF vollkommen unerforscht. In der vorliegenden Arbeit kann erstmals eine signifikante Überexpression von MEF in humanen Glioblastomen verglichen mit gesundem Gehirngewebe nachgewiesen werden. Die Analyse der unterschiedlichen, molekularbiologisch definierten Subtypen des Glioblastoma multiforme zeigte, dass Patienten mit proneuralen Glioblastomen bei niedriger MEF-Expression signifikant länger überleben als Patienten desselben Subtyps mit hoher MEF-Expression. Eine signifikante Häufung der für den proneuralen Subtyp charakteristischen IDH1-Mutation unter den Patienten mit niedriger MEF-Expression und längerem Gesamtüberleben unterstreicht den Einfluss von MEF auf die Progression des proneuralen Glioblastomsubtyps. Äquivalent zu den humanen Daten überleben in einem speziell für den proneuralen Glioblastomsubtyp etablierten Mausmodell Gliom-tragende Mef-/--Mäuse signifikant länger als die entsprechenden Mef-exprimierenden Mäuse. Mef-/--Mäuse weisen zudem signifikant benignere Gliome als die Mef-exprimierenden Mäuse auf. Die Mef-abhängige Entstehung der Gliome wird zum einen über eine stärkere, p53-unabhängige Zellproliferation hervorgerufen, die mit einer erniedrigten p21-Expression in den Mef-exprimierenden Zellen verglichen mit den Mef-/--Zellen assoziiert ist. Zum anderen bewirkt MEF eine signifikante, p53-unabhängige Zunahme von tumorinitiierenden Glioblastomstammzellen sowie ihrer Selbsterneuerung, was anhand einer gesteigerten Neurosphärenbildung, einer Zunahme der die Stammzellen enthaltenden Side Population und einer verstärkten Expression des neuronalen Stammzellmarkers Nestin verdeutlicht wird. Zusätzliche Expressionsanalysen weisen darauf hin, dass MEF direkt über eine Regulation des Transkriptionsfaktors Sox2 als wichtige Komponente im Netzwerk der Stammzell-Signaltransduktion wirkt, während die Transkriptionsfaktoren Oct4 und Nanog möglicherweise indirekt durch MEF beeinflusst werden. Eine für die Radiotherapie von Glioblastompatienten relevante Funktion könnte MEF ebenfalls besitzen, da sich humane Glioblastomzellen gemäß Analysen der subG1-Phase des Zellzyklusses unter Radiotherapie signifikant apoptoseresistenter verhalten, wenn sie MEF exprimieren als bei dessen Verlust. Zusammenfassend geben die Daten dieser Arbeit Anlass zur Hoffnung, in MEF ein für die Tumorentität des Glioblastoma multiforme bedeutsames Onkogen identifiziert zu haben, welches neben seiner wissenschaftlichen Novität zukünftig im klinischen Alltag eine Bedeutung als prognostischer Marker haben könnte. Gemäß den Daten dieser Arbeit könnten insbesondere Patienten, die die molekularen Besonderheiten des proneuralen Subtyps, wie eine IDH1-Mutation, aufweisen, von einer individualisierten Therapie mit MEF-Inhibitoren profitieren, denn Patienten mit einem Glioblastom des proneuralen Subtyps sowie einer niedrigen MEF-Expression zeigen einen signifikanten Überlebensvorteil. Durch eine Behandlung mit einem MEF-Inhibitor könnte bei Glioblastompatienten des proneuralen Subtyps mit hoher MEF-Expression die Wirkung des Onkogens MEF gehemmt und damit das Überleben der Patienten verlängert werden.Glioblastoma multiforme is still a very challenging disease despite a multimodal therapy with surgery, chemotherapy and irradiation. This high malignant tumor is characterized by a high proliferation rate, diffuse infiltration, necrosis, angiogenesis, microvascular proliferation, apoptosis resistance and genomic instability. The median overall survival of glioblastoma patients still remains at 15 months because of the invasive growth and tumor recurrence, so that an intense research for new therapy strategies is needed. An oncogenic function of the transcription factor MEF (Myeloid ELF-1-like factor) is already known for other tumors like the ovarian carcinoma and the acute myeloid leukemia. The effects of MEF in these tumors are mediated by the inhibition of the p53 pathway as well as p53 independent. In brain tumors, the expression and function of MEF have not been investigated until know. A significant overexpression of MEF in human glioblastomas compared to control brain tissue has been described the first time in this thesis. The analysis of different subtypes of glioblastoma multiforme, defined by their molecular biological pattern, showed that patients with proneural glioblastomas and low MEF expression lived significantly longer than patients with the same subtype and high MEF expression. A significant accumulation of the IDH1 mutation, which is characteristic for the proneural subtype, in the patients with low MEF expression and longer overall survival emphasizes the impact of MEF on the progression of the proneural glioblastoma subtype. In agreement with the human data glioma-bearing Mef-/- mice live significantly longer in a proneural glioma mouse model compared to Mef expressing mice. Furthermore, Mef-/- mice show significant less malignant gliomas than Mef expressing mice. On the one hand, the Mef dependent gliomagenesis is mediated by a stronger, p53 independent cell proliferation, which is associated with a lower p21 expression in the Mef expressing cells than in Mef-/- cells. Moreover, MEF causes a significant, p53 independent increase of tumor initiating glioblastoma stem cells and of their self-renewal, detected by an increased neurosphere formation, an augmented Side Population and a higher expression of the neural stem cell marker Nestin. Further expression analyses point to a direct regulation of the transcription factor Sox2, a pivotal component in the network of stem cell signal transduction, by MEF. The transcription factors Oct4 and Nanog are potentially affected by MEF on an indirect way. MEF could be relevant for the irradiation of glioblastoma patients, because human glioblastoma cells behave significantly more resistant against apoptosis under irradiation, if they express MEF measured by subG1 analyses. In summary, the data of this thesis show, that MEF could be a pivotal oncogene for glioblastoma multiforme. In the future, MEF could gain in importance as a prognostic marker in gliomas. Referring to the data of this thesis, in particular patients with the molecular pattern of the proneural subtype, like the IDH1 mutation, could benefit from an individualized therapy with MEF inhibitors, because patients with a glioblastoma of the proneural subtype and a low MEF expression show a significant survival benefit. MEF inhibitors could disrupt the oncogenic effects of MEF for glioblastoma patients of the proneural subtype with high MEF expression and prolong the overall survival

Alleviation of Psychological Distress and the Improvement of Quality of Life in Patients With Amyotrophic Lateral Sclerosis: Adaptation of a Short-Term Psychotherapeutic Intervention

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease that is inevitably fatal. To be diagnosed with a terminal illness such as ALS deeply affects one’s personal existence and goes along with significant changes regarding the physical, emotional, and social domains of the patients’ life. ALS patients have to face a rapidly debilitating physical decline which restrains mobility and impairs all activities of daily living. This progressive loss of autonomy may lead to a sense of hopelessness and loss of quality of life, which in turn may even result in thoughts about physician-assisted suicide. Here, we would like to propose a psychotherapeutic manualized, individual, semi-structured intervention to relieve distress and promote psychological well-being in ALS patients. This short-term intervention was originally developed for advanced cancer patients. “Managing Cancer and Living Meaningfully (CALM)” focuses on the four dimensions: (i) symptom management and communication with healthcare providers, (ii) changes in self and relations with close others, (iii) spirituality, sense of meaning and purpose and (iv) thinking of the future, hope, and mortality. We suggest to supplement the concept by two additional dimensions which take into account specific issues of ALS patients: (v) communication skills, and (vi) emotional expression and control. This therapeutic concept named “ManagIng Burden in ALS and Living Meaningfully (mi-BALM)” may be a further treatment option to help improving quality of life of ALS patients