Untersuchungen des Einflusses metallbasierter Nanopartikel und Nanowire auf die Genexpression sowie die DNA-Integrität in pulmonalen Zellkulturmodellen des Menschen und der Ratte

Das stetig wachsende Feld der Nanotechnologie und die daraus hervorgehende Fülle an neuen innovativen Materialien bergen ein potentielles toxikologisches Risiko für die menschliche Gesundheit. Dementsprechend muss sich auch die Toxikologie fortlaufend weiterentwickeln, um eine zeitgemäße Risikobewertung gewährleisten zu können. Besonders metallbasierte Nanomaterialien weisen neben der größenspezifischen Toxizität auch eine inhärente metallspezifische Toxizität auf, die, je nach Metallspezies, auch eine kanzerogene Wirkung auslösen kann. Neben den seit einiger Zeit bekannten und bereits gut untersuchten metallbasierten Nanopartikeln werden gerade in den letzten Jahren immer häufiger Nanowire in innovativen Produkten eingesetzt, die eine zusätzliche Faser-spezifische Toxizität aufweisen können. Um potentielle adverse Effekte dieser Nanomaterialien zu beurteilen, wurden im Rahmen dieser Arbeit umfangreiche in vitro-Untersuchungen durchgeführt, wobei der Fokus besonders auf dem Einfluss solcher Materialien auf die genomische Stabilität lag. Hierfür kamen verschiedene pulmonale in vitro-Zellsysteme des Menschen in Mono- und Kokultur sowie ein Monokultur-System der Ratte zum Einsatz. Der Vergleich zwischen den beiden Spezies soll dabei die Basis für Untersuchungen auf ex vivo- und in vivo-Ebene bilden und durch die Extrapolation zwischen den Spezies zu einer Reduktion von in vivo-Untersuchungen beitragen. Gegenstand der Analysen waren Kupfer-, Nickel- und Silber-basierte Nanopartikel und Nanowire sowie die Referenzmaterialien CeO2- und TiO2-Nanopartikel als biobeständige Partikelreferenz und Kohlenstoffnanoröhren als biobeständige Faserreferenz. Um eine Bewertungsgrundlage zu schaffen, wurden die Nanomaterialien zunächst einer umfangreichen Materialcharakterisierung unterzogen. Diese umfasste neben elektronenmikroskopischen Untersuchungen auch die Messung der dynamischen Lichtstreuung in Suspension sowie die Bestimmung der Löslichkeit in den verwendeten Zellkulturmedien und weiteren biologisch relevanten Flüssigkeiten. Hierbei zeigten die Kupfer-basierten Nanomaterialien die stärkste Löslichkeit, während für die Silbernanomaterialien sowie die Referenzmaterialien nahezu keine Löslichkeit messbar war. Bei den Löslichkeitsstudien wurde unter anderem eine lysosomale Modelflüssigkeit genutzt, die der Abschätzung einer potentiellen Ionenfreisetzung innerhalb der Lysosomen nach einer endozytotischen Aufnahme dienen sollte. Dieser Prozess, der zur intrazellulären Ionenfreisetzung führen kann, wird als trojan horse mechanism bezeichnet und gilt als einer der Hauptursachen der Toxizität von metallbasierten Nanomaterialien. Die intrazelluläre Ionenfreisetzung und –verteilung in den verwendeten Zelllinien wurde ebenfalls untersucht. Hierbei spiegelten die Ergebnisse zum Großteil die Resultate der Löslichkeitsstudien wider. Eine Ausnahme bildeten die Silbernanomaterialien, für die trotz einer scheinbaren Unlöslichkeit intrazellulär verfügbare Ionen detektiert werden konnten. Dies kann über die Bildung von unlöslichen Sekundärpartikeln aufgrund einer hohen Thiol-Affinität begründet werden. Freie Metallionen stehen im Verdacht, reaktive Sauerstoffspezies zu induzieren und in Folge dessen die Zellen auf verschiedene Arten zu schädigen. Hierzu zählt unter anderem die Induktion inflammatorischer sowie DNA-schädigender Prozesse. Diese Mechanismen wurden mithilfe der Genexpressionsanalyse untersucht. Die in der Arbeitsgruppe etablierte Hochdurchsatz RT-qPCR wurde im Rahmen dieser Arbeit hinsichtlich der Untersuchung von Wirkmechanismen metallbasierter Nanomaterialien um inflammatorische und fibrotische Marker erweitert und zudem um ein Gen-Set zur Untersuchung von Rattenzellen ergänzt. Dabei lösten die Kupfer-basierten Nanomaterialien in den humanen Zellsystemen die stärksten Veränderungen der Expressionsprofile aus, während in den Rattenzellen die Nickel-basierten Nanomaterialien den größten Einfluss besaßen. Insgesamt induzierten die löslichen Nanomaterialien vor allem Gene, die auf freie Metallionen, oxidativen Stress sowie Inflammation hindeuten und bestätigten damit den prognostizierten trojan horse mechanism. Zudem konnten Faser-spezifische Effekte durch eine stärkere Induktion inflammationsbezogener Gene in der Kokultur nach der Inkubation mit Nickel- und Silber-Nanowire beobachtet werden, die vermutlich mit einer Aktivierung der Makrophagen und dem Prozess der sog. „frustrierten Phagozytose“ zusammenhängen. Über die alkalische Entwindung sowie den durchflusszytometrischen Mikrokerntest wurden zusätzlich DNA-schädigende Effekte untersucht. Das größte genotoxische Potential zeigten die Kupfernanomaterialien, wobei sich die Anzahl an DNA-Strangbrüchen in der Kokultur auf das Doppelte bis Dreifache im Vergleich zur Monokultur belief. Dies könnte mit dem Auftreten einer sekundären Genotoxizität, ausgelöst durch die Makrophagen, begründet werden. Unterschiede zwischen den beiden Testsystemen ergaben sich vor allem für die Nickel- und Silber-basierten Nanowire sowie die Kohlenstoffnanoröhren, die ausschließlich im Mikrokerntest eine Genotoxizität aufwiesen. Dies spricht für einen Faser-spezifischen klastogenen Effekt. Demgegenüber konnten für die unlöslichen CeO2- und TiO2-Nanopartikel keine adversen Effekte detektiert werden. Zusammenfassend konnten bestehende Theorien zum Wirkmechanismus metallbasierter Nanomaterialien nachvollzogen und um neue Erkenntnisse, insbesondere bezüglich der Nanowire, erweitert werden. So konnte der für die Toxizität dieser Materialien postulierte trojan horse mechanism in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden, ebenso wie die Induktion von oxidativem Stress, der in der Ausbildung inflammatorischer Prozesse und einer DNA-schädigenden Wirkung resultierte. Unter den Kupfernanomaterialien konnte kein Unterschied zwischen Partikel und Wire ausgemacht werden, weshalb diese Spezies vermutlich vorrangig über die intrazelluläre Ionenfreisetzung toxisch wirken. Im Gegensatz hierzu konnte die Toxizität von Nickel- und Silber-basierten Nanomaterialien nicht ausschließlich auf die Ionen zurückgeführt werden, da die Nanowire, genau wie auch die Kohlenstoffnanoröhren, Faser-spezifische Effekte auslösten. Hierbei zeigte sich besonders in der Genexpressionsanalyse auch der Einfluss der Makrophagen, was die Relevanz der Zell-Zell-Kommunikation und deren Berücksichtigung in in vitro-Anwendungen unterstreicht. Der Vergleich der beiden Spezies Mensch und Ratte zeigte eine größere Empfindlichkeit der Rattenzellen in nahezu allen durchgeführten Experimenten, trotz einer zumeist ähnlichen intrazellulären Bioverfügbarkeit des jeweiligen Metalls. Dies könnte in einer potenteren anti-oxidativen Abwehr der humanen Zelllinie begründet sein. Im Zusammenhang mit dem BMBF-geförderten Projekt MetalSafety, in dessen Rahmen die vorliegende Arbeit entstand, bieten diese Ergebnisse die Grundlage für eine Risikobewertung der untersuchten Nanomaterialien. Durch die Verwendung von humanen Zellkulturen und einer Zelllinie aus der Ratte konnte zudem eine Datenbasis geschaffen werden, um mittels weiterer in vitro-, ex vivo- und in vivo-Experimente im Rahmen des Projekts das Verständnis der Vergleichbarkeit von in vitro-, ex vivo- und in vivo-Untersuchungen zu vertiefen und so in Zukunft potentiell die Anzahl an Versuchstieren reduzieren zu können

Impact of differentiated macrophage-like cells on the transcriptional toxicity profile of cuo nanoparticles in co-cultured lung epithelial cells

To mimic more realistic lung tissue conditions, co-cultures of epithelial and immune cells are one comparatively easy-to-use option. To reveal the impact of immune cells on the mode of action (MoA) of CuO nanoparticles (NP) on epithelial cells, A549 cells as a model for epithelial cells have been cultured with or without differentiated THP-1 cells, as a model for macrophages. After 24 h of submerged incubation, cytotoxicity and transcriptional toxicity profiles were obtained and compared between the cell culture systems. Dose-dependent cytotoxicity was apparent starting from 8.0 µg/cm$^{2}$ CuO NP. With regard to gene expression profiles, no differences between the cell models were observed concerning metal homeostasis, oxidative stress, and DNA damage, confirming the known MoA of CuO NP, i.e., endocytotic particle uptake, intracellular particle dissolution within lysosomes with subsequent metal ion deliberation, increased oxidative stress, and genotoxicity. However, applying a co-culture of epithelial and macrophage-like cells, CuO NP additionally provoked a pro-inflammatory response involving NLRP3 inflammasome and pro-inflammatory transcription factor activation. This study demonstrates that the application of this easy-to-use advanced in vitro model is able to extend the detection of cellular effects provoked by nanomaterials by an immunological response and emphasizes the use of such models to address a more comprehensive MoA

Comparison of Metal-Based Nanoparticles and Nanowires: Solubility, Reactivity, Bioavailability and Cellular Toxicity

While the toxicity of metal-based nanoparticles (NP) has been investigated in an increasing number of studies, little is known about metal-based fibrous materials, so-called nanowires (NWs). Within the present study, the physico-chemical properties of particulate and fibrous nanomaterials based on Cu, CuO, Ni, and Ag as well as TiO2 and CeO2 NP were characterized and compared with respect to abiotic metal ion release in different physiologically relevant media as well as acellular reactivity. While none of the materials was soluble at neutral pH in artificial alveolar fluid (AAF), Cu, CuO, and Ni-based materials displayed distinct dissolution under the acidic conditions found in artificial lysosomal fluids (ALF and PSF). Subsequently, four different cell lines were applied to compare cytotoxicity as well as intracellular metal ion release in the cytoplasm and nucleus. Both cytotoxicity and bioavailability reflected the acellular dissolution rates in physiological lysosomal media (pH 4.5); only Ag-based materials showed no or very low acellular solubility, but pronounced intracellular bioavailability and cytotoxicity, leading to particularly high concentrations in the nucleus. In conclusion, in spite of some quantitative differences, the intracellular bioavailability as well as toxicity is mostly driven by the respective metal and is less modulated by the shape of the respective NP or NW