Biophysical characterization of an essential protein complex for bacterial cell wall formation

Orientador: Andréa Dessen de Souza e SilvaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: As interações entre proteínas desempenham papéis biológicos importantes nas células, como no caso da biossíntese do peptideoglicano (PG), maior componente da parede celular bacteriana e responsável por definir a morfologia e proteger a célula do estresse causado pela alta pressão osmótica intracelular presente tanto em bactérias Gram-negativas como Gram-positivas. A síntese do PG é um processo dinâmico e altamente complexo, consistente de muitos passos de síntese que são orquestrados por diferentes enzimas localizadas em diferentes espaços na célula. As ligases Mur (MurC a MurF) são as proteínas responsáveis por catalisar a síntese dos precursores de PG no citoplasma juntamente com as proteínas MurG e MraY, as quais também estão relacionadas com a síntese dos precursores do PG na membrana, lipídeo I e lipídeo II, respectivamente. Esse grupo de proteínas são essenciais para a sobrevivência da bactéria e são encontradas somente em células de organismos procariota, deste modo, tornando-se alvos potenciais para o desenvolvimento de novos antibióticos. No presente trabalho foi realizada a expressão e purificação de MraY de Streptococcus pneumoniae, proteína integral de membrana, e foi analisada a sua possível interação com a enzima MurF. Existem muitas evidências sobre a formação de complexos entre essas proteínas, no entanto este trabalho descreve de forma inédita a interação direta entre as ligases Mur de Streptococcus pneumoniae, as quais formam um mega-complexo em solução. Também observamos que a interação entre essas proteínas está fortemente relacionada com a presença dos seus estados oligoméricos. Outro achado inédito é a habilidade de MurG de se auto associar em diferentes espécies, dependendo da concentração de detergente em solução, representando um processo dinâmico, importante para a montagem do mega-complexo entre as ligases Mur, uma vez que a interação entre essas proteínas também foi observada neste estudo. Assim, a formação do mega-complexo pode ser explorada como um mecanismo regulatório espacial e temporal da síntese do peptideoglicanoAbstract: Protein interactions play important biological roles for cells, as in the case of the biosynthesis of peptidoglycan (PG), the major component of the bacterial cell wall. The PG is involved in the determination of cell morphology and protection against osmotic stress, both in Gram-negative and Gram-positive bacteria. The synthesis of PG is a dynamic and highly complex process, which requires many steps mediated by different enzymes located in different compartments of the cell. The Mur (MurC to MurF) ligases are responsible for the catalysis of the synthesis of PG precursors in the cytoplasm, together with the MurG and MraY proteins, which are related to the synthesis of lipid I and lipid II respectively. These proteins are essential for bacterial survival and are found only in prokaryotic organisms, and are thus potential targets for the development of new antibiotics. Here we present the expression and purification of MraY from Streptococcus pneumoniae, an integral membrane protein, as well as its analysis of the interaction with MurF. There is vast evidence regarding the formation of complexes between these proteins; however, this work describes, for the first time, the direct interaction between the Mur ligases of Streptococcus pneumoniae, which form a mega-complex in solution. We also observed that the interaction between these proteins is strongly related to the presence of their oligomeric forms. Interestingly, we have found that S. pneumoniae MurG is able to self-associate and form different oligomeric species in solution. This fact represents a dynamic process, important for the assembly of a mega-complex within the cytoplasm, and could be representative of a spatial and temporal PG-regulatory mechanismDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutora em Genética e Biologia Molecular2013/02451-0FAPES