Studies on cytotoxic activity of organometallic complexes of Mo(II) with α-diimines

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), milhões de pessoas vivem com o diagnóstico de cancro e esta é uma das doenças que causa mais mortes, a nível mundial (cerca de 8 milhões de mortes por ano). Se esta tendência não for invertida, estima-se que em 2030, 12 milhões de pessoas morram devido ao cancro. A investigação nesta área tão importante é, inquestionavelmente, necessária. Foram identificados mais de 200 tipos diferentes de cancro, todos caracterizados pelo crescimento e proliferação descontrolados de células anormais. Atualmente, a quimioterapia, radioterapia e cirurgia são os principais tipos de tratamento do cancro, sendo a quimioterapia a opção mais comum e com mais resultados favoráveis. Os fármacos usados na quimioterapia possuem, cada vez mais, alvos biológicos específicos, como proteínas e enzimas ou o DNA de células cancerígenas, tentando não afetar as células normais e saudáveis. Na segunda metade do século XX, houve um grande avanço na história da quimioterapia com a descoberta da cisplatina que, ainda hoje em dia, juntamente com os seus análogos são os fármacos mais utilizados no tratamento de tumores sólidos, devido à sua elevada eficácia. No entanto, estes compostos de platina apresentam diversas limitações, nomeadamente resistência das células tumorais aos compostos e elevada toxicidade destes. Contudo, a descoberta da cisplatina levou à investigação da atividade anti-tumoral de outros compostos com centros metálicos, como o molibdénio, ruténio, ouro, ferro, entre outros. Foram feitos vários estudos citotóxicos com compostos contendo molibdénio, tendo sido comprovadas as suas propriedades anti-tumorais. No entanto, o seu mecanismo de ação encontra-se ainda por esclarecer. Este trabalho teve como objetivo o estudo das propriedades anti-tumorais de cinco complexos organometálicos de molibdénio(II), [Mo(η3-C3H5)Br(CO)2{1,4-X-fenil-2,3-naftalenodiazobutadieno}], com X = H (C1), Me (C2), OMe (C3), Cl (C4) e COOH (C5). Estes complexos foram sintetizados por reação do precursor de molibdénio(II) [Mo(η3-C3H5)Br(CO)2(MeCN)] (P0) com diferentes ligandos bidentados azotados da família das α-diiminas (L1 – L5) e foram caracterizados por FTIR e 1H NMR. Realizaram-se ensaios de voltametria cíclica para estudar as propriedades de oxidação/redução dos complexos C1 – C5. Nos voltamogramas cíclicos obtidos para cada complexo, foram observadas ondas de oxidação de maior intensidade e uma onda de redução de menor intensidade. As oxidações estão associadas ao processo de oxidação de Mo(II) a Mo(III) e as reduções ocorrem no ligando, de acordo com a composição das HOMOs e LUMOs dos complexos calculadas por DFT (do inglês, Density Functional Teory). Os complexos apresentam em geral um comportamento de oxidação irreversível, comprovado pela diferença (ΔE) de potencial de oxidação (Epox) e potencial de redução (Epred), ΔE = Epox - Epred > 0.059. Realizaram-se estudos de citotoxicidade destes compostos em diversas linhas celulares tumorais humanas: HeLa (células endoteliais do cancro do colo do útero), MCF-7 e MDA (células epiteliais do cancro da mama), SW480 e Caco-2 (células epiteliais do cancro do cólon) utilizando o ensaio de viabilidade celular MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio). Os resultados de IC50 obtidos (concentração necessária para inibir metade do crescimento celular) mostram que estes complexos têm uma elevada atividade citotóxica in vitro nas linhas tumorais estudadas, com valores de IC50 a variar entre 3,2 e 27,1 μM em células HeLa. Nas células SW480 obtiveram-se valores de IC50 entre 0,6 e 50 μM e para as células MCF-7, IC50 a variar entre 25 e 98,4 μM. Observou-se uma possível resistência das linhas celulares MDA-MB-231 e Caco-2 células aos compostos, traduzido por um menor efeito anti-tumoral, e refletido em valores de IC50 maiores que 100 μM. O complexo C3 é o mais citotóxico, uma vez que apresenta o menor valor de IC50, dos cinco compostos, em todas as linhas celulares estudadas. Por outro lado, o complexo C5 é o que tem o maior valor de IC50 em todas as linhas celulares testadas, sendo o que tem um efeito anti-tumoral mais baixo. Uma vez que a maioria dos complexos organometálicos têm como alvo o DNA das células tumorais, foram feitos ensaios de titulação de calf thymus DNA (CT DNA) usando espectrofotometria de UV-Vis para detetar a interação destes complexos de molibdénio(II) com o DNA, de modo a tentar elucidar o seu mecanismo de ação. Os espectros obtidos para cada complexo mostraram uma diminuição da intensidade da absorvência dos complexos (hipocromismo), acompanhada de um desvio para o vermelho (batocromismo), medidos a um determinado comprimento de onda, após a adição (e consequente aumento de concentração) de CT DNA. Isto indica uma interação dos compostos de molibdénio(II) com o CT DNA. Foram calculados os valores da constante de ligação intrínseca (Kb) entre o CT DNA de cada complexo, obtendo-se maiores valores de Kb para os complexos C3 e C5 (Kb = 4.47 х 104 M-1 e 6.53 х 104 M-1, respetivamente) e o menor valor para o complexo C2 (Kb = 2.11 х 104 M-1). Assim sendo, os complexos C3 e C5 interagem mais fortemente com o DNA e o complexo C2 apresenta a interação mais fraca com esta molécula biológica. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram a identificação de complexos organometálicos de molibdénio(II) como potenciais agentes anti-tumorais, a partir dos estudos de atividade citotóxica em diferentes linhas celulares, e o esclarecimento de um dos possíveis mecanismos da sua ação em células cancerígenas, através da interação destes com o DNA, levando à inibição do crescimento das células tumorais e, consequente morte celular. Muitos mais estudos teriam de ser realizados para compreender melhor a interação destes compostos, não só com o DNA, mas com os outros constituintes celulares (enzimas, proteínas, membranas, etc), de modo a poder investigar a potencialidade destes compostos C1 a C5 em quimioterapia. Este fato pode trazer novas perspetivas a esta área de investigação, de modo a ultrapassar as limitações existentes nos fármacos atualmente usados na quimioterapia. Com efeito, estes compostos organometálicos de Mo(II) apresentam propriedades químicas diferentes das dos complexos em fases mais avançadas de desenvolvimento ou mesmo em utilização clínica. A utilização destes ligandos bidentados azotados da família das α-diiminas e a possibilidade de combinar outros novos ligandos ao molibdénio constituem uma mais valia no tratamento no cancro.Five molybdenum(II) complexes, [MoBr(η3-C3H5)(CO)2{1,4-(4-X)phenyl-2,3-naphthalenediazabutadiene}], X = H (C1), Me (C2), OMe (C3), Cl (C4) and COOH (C5), were synthesized and characterized by FTIR and 1H NMR spectroscopy. Their redox properties were studied by cyclic voltammetry and strong oxidation waves and less intense reduction waves were observed in the cyclic voltammograms. The difference between the oxidation and reduction potentials (ΔE = Epox - Epred > 0.059) indicated irreversible processes, namely Mo(II) to Mo(III) oxidations and reductions occurring at the ligand. The cytotoxic activity of C1 – C5 was studied in vitro against several cancer cell lines (HeLa, MCF-7, MDA-MB-231, SW480 and Caco-2), using a colorimetric assay, MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). All the complexes display a powerful cytotoxic activity in vitro against HeLa (with IC50 values ranging from 3.2 to 27.1 μM) and a smaller antitumoral effect against MDA-MB-231 and Caco-2 cells (IC50 > 100 μM). C3 is the most cytotoxic complex, with lowest IC50, while C5 has the highest IC50 value, in all cell lines tested. The interaction of these molybdenum(II) complexes with CT DNA was studied, using absorption titration spectroscopy, in order to elucidate their mechanism of action. The absorption spectra of C1 – C5 showed a decrease in the intensity of the absorbance (hypochromism), accompanied by a small red-shift (batochromism) with increasing CT DNA concentration, which indicates an interaction of the complexes with CT DNA. The intrinsic binding constant values (Kb) show that C3 and C5 bind strongly to the CT DNA (Kb = 4.47 х 104 M-1 and 6.53 х 104 M-1, respectively) and C2 has the weakest interaction with CT DNA (Kb = 2.11 х 104 M-1). These results support the capability of these molybdenum(II) complexes for potential application in chemotherapy