New insights into the structure and function of human phenylalanine hydroxylase : interallelic complementation, protein misfolding and mechanism of catalytic activation

Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive human inborn error of metabolism caused by dysfunction of the liver homotetrameric/homodimeric enzyme phenylalanine hydroxylase (hPAH), which results in increased levels of L-phenylalanine (L-Phe) in the blood and if untreated causes severe mental retardation. More than 550 mutations have been identified to date, with three quarters of PKU patients being compound heterozygous, leading to a high phenotypic diversity. Inconsistencies in some genotype-phenotype correlations with more severe phenotypes than the ones expected and lack of response to cofactor ((6R)-L-erythro-5,6,7,8- tetrahydrobiopterin (BH4)) supplementation in patients with two known responsive mutations have raised the possibility of interallelic complementation (IC). We have shown that mutations involved in inconsistencies (I65T, R261Q, R270K and V338M) display a negative IC, with reduced enzymatic activity when mimicking the heteroallelic state of compound heterozygous PKU patients. Moreover, using wild-type and truncated mutants forms we were able to isolate an heterotetrameric hPAH form, WT/ΔN102-hPAH, that resulted from the assembly of two homodimers, since heterodimers did not form. This hybrid species revealed kinetic and regulatory properties that were influenced by interactions between the two homodimers within the heterotetramer. Phenylketonuria is considered a protein misfolding disease with loss of function, as a large number of point mutations result in decreased stability, aggregation and accelerated protein degradation. The deleterious effects seem to particularly affect the R-domain of hPAH that contains an ACT module found in a large number of multimeric proteins with complex allosteric regulation. Here we have studied the effect of the missense mutation G46S in the R-domain that promotes self-association and fibril formation in vitro. The mutation seems to extend α-helix 1 and thus perturbs the α-β sandwich of the ACT module in the R-domain. We were able to modulate in vitro the mutant self-association process by chemical, pharmacological and molecular chaperones. The mutant G46S dimer also self-associates forming fibrils and an enhancement in the self-association was observed in the presence of WT dimer, due to hybrid formation (WT/G46S). However, only amorphous aggregates were observed and L-Phe binding precludes the self-association of the WT dimer, since the wild-type and mutant tetramer dimer equilibrium responds differently to the presence of L-Phe, thus explaining the phenotype of WT/G46S carriers, as none of the PKU heterozygous shows any clinical phenotype. The R-domain of full-length hPAH is particularly unstable and when isolated it self-associates even in its WT form. This self-association was inhibited stereospecifically by L-Phe, pointing to a regulatory binding site that has been disputed over the years. It seems now evident that the isolated R-domain is able to bind L-Phe as we and other groups have observed, but the full-length enzyme has lost this ability with the simultaneously acquiring of complex regulatory mechanisms. One of these regulatory mechanisms comprises the catalytic activation by the substrate. In the resting state hPAH is inhibited by the cofactor BH4. Binding of L-Phe triggers a series of conformational changes that resulted in the activation of the enzyme. Crystal structures of hPAH with bound cofactor and substrate have revealed a large displacement of Tyr138 in a highly flexible loop, from a surface position to a partial buried position at the active site upon substrate binding. Here we have found an important functional role for Tyr138 displacement in positioning substrates for catalysis and in the L-Phe triggered conformational isomerization that results in catalytic activation of the enzyme.A fenilcetonúria (PKU; OMIM 261600) é uma doença autossómica recessiva do metabolismo, causada por uma deficiente actividade da enzima homotetramérica/homodimérica fenilalanina hidroxilase (hPAH; EC 1.14.16.1). A enzima existe maioritariamente nos hepatócitos, onde é responsável pela hidroxilação da L-fenilalanina (L-Phe) em L-tirosina (L-Tyr) na presença do cofactor (6R)-L-eritro-5,6,7,8-tetrahidrobiopterina (BH4) e oxigénio. Nesta reacção ocorre simultaneamente a hidroxilação do cofactor, que posteriormente é regenerado pela acção da enzima dihidrobiopterina reductase. A fenilalanina hidroxilase é responsável pela homeostase da L-Phe, de forma a impedir o aumento dos níveis deste aminoácido, que são tóxicos para o cérebro, e simultaneamente evitar a sua completa depleção, comprometendo a síntese proteica. Deste modo, a enzima sofre uma regulação complexa, que envolve a activação catalítica pelo substrato L-Phe, com cooperatividade positiva e fosforilação do resíduo Ser16. A enzima é também regulada pelo cofactor BH4, que provoca a sua inibição e estabilização num estado inactivo, na ausência de L-Phe. Mais de 550 mutações foram identificadas no gene PAH humano, resultando em proteínas mutantes com baixa actividade e/ou estabilidade e consequente aparecimento da doença. Esta é caracterizada pelo aumento dos níveis de fenilalanina plasmática (hiperfenilalaninémia; HPA) e pela diminuição do teor de tirosina circulante. Na ausência de tratamento, a PKU resulta em atraso mental profundo. A terapêutica actual consiste na detecção da doença através do rastreio neonatal e na implementação imediata de uma dieta pobre em L-Phe, com controlo da tolerância ao aminoácido, a qual tem de ser mantida para a vida. Recentemente verificou-se que algumas mutações respondem à administração oral do cofactor BH4 (suplementação com BH4), especialmente as formas menos graves da doença, permitindo o aumento da actividade enzimática e consequente relaxamento da dieta. Este encontra-se já comercialmente disponível na forma sintética do isómero 6R do BH4 (cloreto de sapropterina, Kuvan). Devido à heterogeneidade da doença, mais de 75% dos doentes são heterozigóticos compostos (portadores de duas diferentes mutações). Em alguns destes doentes foram verificadas inconsistências tanto ao nível da correlação genotipo-fenótipo do récem-nascido HPA, quer ao nível da resposta à suplementação com BH4. A correlação genótipo/fenótipo bioquímico tem sido efectuada com base na actividade residual prevista (PRA), calculada pela média das actividades determinadas in vitro de cada uma das proteínas mutantes associadas ao genótipo do doente. Em alguns doentes heterozigóticos compostos foram descritos fenótipos mais severos do que os previstos pela determinação da PRA. Particularmente, correlações genótipo-fenótipo em doentes HPA Portugueses envolvendo as mutações I65T, R261Q, R270K e V338M revelaram inconsistências. No que diz respeito à suplementação com BH4, alguns heterozigóticos compostos não revelaram uma resposta positiva ao tratamento, embora as duas mutações presentes no seu genótipo se encontrem descritas como respondendo ao BH4 em doentes homozigóticos para as mesmas. Curiosamente, algumas dessas mutações estão relacionadas com as inconsistências detectadas ao nível de correlações genótipo-fenótipo (e.g. I65T e R261Q). De forma a explicar estas observações clínicas foi proposta a existência de fenómenos de complementação interalélica, a qual terá como base interacções entre as diferentes subunidades mutantes da enzima multimérica, originando uma proteína com menor actividade/estabilidade do que a prevista pela PRA (neste caso uma complementação inter-alélica negativa). De forma a estudar este fenómeno desenvolvemos sistemas de expressão procariótica de forma a produzir e isolar os possíveis híbridos. Utilizando um sistema de expressão dupla foi possível reproduzir bioquimicamente a situação de um heterozigótico composto (tetrâmeros, heterotetrâmeros e dímeros) com as combinações das mutações descritas anteriormente. Todas estas mutações revelaram uma diminuição da actividade enzimática quando comparada com a prevista pela PRA, demonstrando a existência de fenómenos de complementação inter-alélica negativa. Com a utilização da forma selvagem (WT) e mutantes de deleção num sistema bicistrónico foi possível isolar pela primeira vez um híbrido da hPAH, neste caso um heterotetrâmero WT/ΔN102-hPAH. Nestes estudos, a existência de heterodímeros foi excluída, explicando o facto da hPAH selvagem ser isolada como tetrâmeros e dímeros, mas nunca como monómeros. O heterotetrâmero isolado apresenta propriedades cinéticas e reguladoras que demonstram a existência de interacções entre os dois dímeros na proteína híbrida. Estes resultados foram corroborados pela formação de heterotetrâmeros a partir de homodímeros préformados da forma selvagem e de um mutante com uma elevada propensão para agregar (WT/G46S). A presença do mutante leva à agregação da proteína WT, processo este dependente da presença de L-Phe, pois o equilíbrio entre as diferentes formas oligoméricas responde de forma diferente à presença do substrato. A vasta maioria das mutações que afectam a proteína hPAH levam a uma diminuição da eficiência do folding proteico e/ou na redução da estabilidade da enzima, resultando na sua agregação e/ou rápida degradação. O domínio regulador da enzima revela uma reduzida estabilidade e o seu envolvimento no processo de misfolding tem sido evidenviado nos últimos anos. O estudo da mutação G46S, localizada no domínio regulador e que resulta na forma mais grave da doença, permitiu avaliar o processo de misfolding de um mutante envolvendo este domínio. Em estudos in vitro, a proteína mutante agrega, levando à formação de fibrilas. Este processo foi inibido parcialmente pela utilização de glicerol (chaperone químico), 3-amino-2- benzil-7-nitro-4-(2-quinolil)-1,2-dihidroisoquinolina-1-ona (um chaperone farmacológico recentemente proposto) e pelos chaperones moleculares Hsp70/Hsp40 e Hsp90. O domínio regulador da hPAH apresenta um módulo ACT, que ocorre em várias enzimas multiméricas com complexos modos de regulação. Os módulos ACT formam normalmente dímeros e estão envolvidos na ligação de aminoácidos nas interfaces entre as duas subunidades. A instabilidade do domínio regulador da hPAH, onde não é possível existir a formação de dímeros entre os módulos ACT, foi também analisada pelo estudo deste na sua forma isolada. Curiosamente, tanto o domínio regulador mutante como o selvagem revelam tendência para agregar. No entanto, a agregação é inibida estereo-especificamente na forma selvagem pela fenilalanina, indicando que o domínio regulador na forma isolada consegue ligar o substrato, embora na enzima full-length, essa capacidade tenha sido perdida. A ligação do substrato L-Phe ao sítio activo da enzima resulta num processo reversível de isomerização que ocorre numa escala de segundos a minutos. Este processo converte a enzima de um estado de baixa actividade/afinidade para um estado de alta actividade/afinidade, resultando na activação da enzima e na existência de cooperatividade positiva. Dado a inexistência da estrutura cristalográfica da enzima full-length, não foi possível até ao momento estabelecer o circuito de alterações conformacionais que levam à activação da enzima. No entanto, a existência de estruturas proteicas de formas truncadas do domínio catalítico da enzima em complexos binários (hPAH·(Fe(II)-cofactor) e ternários (hPAH·(Fe(II)-cofactor-substrato) permitiram verificar a existência de alterações conformacionais ao nível do domínio catalítico. Uma dessas alterações envolve o reposicionamento de um loop flexível da superfície da enzima para uma posição mais hidrofóbica no sítio activo da proteína. A maior alteração envolve o resíduo Tyr138, cuja cadeia lateral sofre uma deslocação de ∼21 Å. De forma a compreender a função desempenhada por este loop e em particular o papel desempenhado pela Tyr138, o resíduo foi mutado e o seu efeito avaliado ao nível do impacto na actividade enzimática e eficiência de coupling (co-hidroxilação de substrato e cofactor), bem como na isomerização da proteína. Estes resultados permitiram identificar que a Tyr138 desempenha um papel ao nível do reposicionamento dos substratos para catálise, mas sem afectar o coupling da reacção. No entanto, o resíduo Tyr138 também desempenha um papel regulador na isomerização conformacional desencadeada pela ligação do substrato no sítio activo, preenchendo mais uma lacuna no objectivo de compreender o processo de activação catalítica na fenilalanina hidroxilase humana.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/19024/2004. POCI and FSE