Protéolyse enzymatique d'un gel (microrhéologie et mécanisme de dégradation)

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Antagonistic Enzymes May Generate Alternate Phase Transitions Leading to Ephemeral Gels

In some biological processes, two enzymes with antagonistic activities—the one creating a bond, the other destroying it—are involved in a reaction cycle. Several catalysts have the ability to modify the rheological properties of biological media participating in the production of a solid gel phase which later dissolves. Transglutaminase, catalyzing intermolecular protein cross-linking, is considered here as a reverse protease as far as the physical state of a proteic gel is concerned. A kinetic model including diffusion constraints and based on a protease/transglutaminase cycle interconverting insoluble gel and soluble proteolysis fragments showed that alternate sol/gel and gel/sol transitions could occur within such a system, generating transient gel phases. Then, ephemeral gels were obtained in vitro using an experimental system consisting of gelatin, transglutaminase, and thermolysin. Modulating the enzyme activity ratio allows us to “program” the global behavior: polymerization/solubilization cycle of a mixture containing at least one protein and two enzymes without any change in temperature or medium composition

Remodelage enzymatique de gels de gélatine (influence de la spécificité protéolytique et de l'acide hyaluronique)

Les gels sont des milieux non conventionnels régis par des transitions de phase sol-gel et gel-sol. Leur étude présente un intérêt aussi bien au niveau fondamental qu au niveau appliqué. En effet, certains milieux biologiques, comme la matrice extracellulaire, sont assimilables à un milieu gélifié. Au sein du laboratoire, un nouveau biomatériau a été mis en place et nommé Enzgel : il consiste en une solution capable de subir successivement une transition sol-gel puis une transition gel-sol, indépendamment des conditions physico-chimiques et de façon programmable. Il est obtenu à partir d une solution de gélatine, protéine dérivée du collagène, incluant deux enzymes à activités antagonistes (la transglutaminase et une protéase). La double transition, d un point de vue temporel, et les propriétés viscoélastiques sont dictées par les concentrations et le rapport entre les deux activités enzymatiques. La thèse s intéresse notamment à l importance de la spécificité protéolytique dans le remodelage du gel de gélatine. Trois types de protéases ont été testés, la thermolysine, la trypsine et la collagénase. Chacune est caractérisée par une spécificité de clivage des protéines et par une sensibilité vis-à-vis de la conformation de la gélatine (forme coïl ou triple hélice) ainsi que de la présence de liens covalents. Il a été montré une importance de cette spécificité sur les caractéristiques des Enzgels. La deuxième partie de la thèse s intéresse à l influence de l acide hyaluronique sur la gélification de la gélatine et sur l évolution viscoélastique des Enzgels. C est un polysaccharide matriciel qui possède notamment des propriétés rhéologiques remarquables puisqu il est capable de former un réseau d enchevêtrement. Il a été montré que lorsqu il se trouve en présence de gélatine, l acide hyaluronique conférait des propriétés mécaniques nouvelles aux solutions et aux gels. Le système Enzgel est applicable aussi en présence d acide hyaluronique. Par contre, il influence les caractéristiques viscoélastiques globales des Enzgels, ainsi que la quantité de collagénase à utiliser pour obtenir la double transition. Le polysaccharide est spécifiquement dégradable par la hyaluronidase. Ce remodelage dépend de la quantité d'enzyme, de la température ainsi que de l état du milieu: solution ou gel. Dans le cas des Enzgels, une synergie s installe entre la protéase et la hyaluronidase dans la chute de la viscoélasticité lors de la resolubilisation du système. Elle dépend de la quantité de hyaluronidase utilisée et peut aller jusqu'à la suppression totale de l'effet de l'acide hyaluronique. L'ensemble de ces études a permis de mettre au point des Enzgels de compositions très variées couvrant une large gamme de propriétés et offrant de nouveaux débouchés à ce nouveau type de biomatériau.Gels are from the non-conventional media governed by sol-gel and phase transitions. Their studies find interest about both fundamental and applied level. Indeed, some biological media, as the extracellular matrix, are like to a gel. Within the laboratory, a new biomaterial was established and named Enzgel: it consists of a solution able to undergo a sol-gel transition successively followed by transition gel-sol, independently of physicochemical conditions and by programmable way. It is obtained from a solution of gelatin including two antagonists enzymes activities (a transglutaminase and a protease). The double transition, in terms of time and the viscoelastic properties, are dictated by the concentrations and the ratio between the two enzymatic activities. The thesis focuses on the importance of proteolytic specificity in the remodeling of gelatin gel. Three types of proteases were tested, thermolysin, trypsin and collagenase. Each is characterized by specific cleavage of protein and sensitivity towards the conformation of gelatin (coïl form or triple helix) as well as the presence of covalent bonds. It has been shown importance of this specificity on the Enzgels characteristics. The second part of the thesis focuses on the influence of hyaluronic acid on the gelatin gel and evolution of Enzgels viscoelastic. It is a matrix polysaccharide that has remarkable rheological properties since it is form entanglement network. It has been shown that in the presence of gelatin, hyaluronic acid confer new mechanical properties. The Enzgel system is applicable also in the presence of hyaluronic acid. However, polysaccharide influences viscoelastic characteristics of Enzgels and the amount of collagenase to use for to get the double transition. The polysaccharide is specifically degradable by hyaluronidase. This remodeling depends on the amount of enzyme, temperature and the state of media: solution or gel. In the case of Enzgels, synergy between the protease and hyaluronidase became in the fall of viscoelasticity during resolubilisation of system. It depends on the amount of hyaluronidase used allow to total elimination of the effect of hyaluronic acid. These studies have helped to develop Enzgels of highly varied compositions covering a wide range of properties and offering new opportunities to this new type of biomaterial.CERGY PONTOISE-BU Saint-Martin (951272103) / SudocSudocFranceF

Délivrance moléculaire par contrôle de la dynamique de gels supports (étude en vue de l'élaboration d'un nouveau type de pansement)

Les gels sont des solides mous constitués d'un réseau de molécules emprisonnant une phase liquide. Certains gels constitués de polymères biologiques sont appelés biogels. Biocompatibles, biorésorbables et déformables, ils possèdent une structure similaire à la matrice extracellulaire. De plus, la phase aqueuse d'un gel représente 95% de sa masse. Il est donc possible d'inclure des molécules au sein du réseau gélifié et de les faire diffuser vers l'extérieur. Ces qualités confèrent aux biogels de grandes potentialités en tant que biomatériaux innovants et systèmes de délivrance thérapeutique.Durant cette thèse, nous avons étudié la diffusion des molécules à partir de différents gels de gélatine.Dans un premier temps la diffusion à partir d'un gel chimique à été caractérisée grâce à l'utilisation de différentes molécules modèles. Elles balaient une large gamme de poids moléculaire et de charge ionique. Il a été montré que la diffusion depuis ces gels dépend de la nature du réseau de gélatine et de la nature des molécules diffusantes.Dans un second temps, les gels chimiques de gélatine ont été modifiés afin de contrôler et stimuler la libération moléculaire. Cinq nouvelles matrices gélifiées ont donc été synthétisées puis testés en diffusion. La phase sol du gel a tout d'abord été modifiée à l'aide d'un polymère viscosigène : l'alginate. Celui-ci limite la diffusion de certaines molécules. De plus son hydrolyse progressive induit la libération graduelle de molécules piégées. Le réseau de gélatine a ensuite été modifié. La synthèse d'un deuxième réseau au sein du gel de gélatine augmente ses capacités de rétention. Enfin l'utilisation de la technologie enzgel permettant la resolubilisation enzymatique contrôlée et programmée du gel de gélatine permet la libération massive et totale des molécules.Dans un troisième temps, l'ensemble des résultats de diffusion a permis la mise au point d'un unique modèle mathématique de diffusion pour l'ensemble des matrices. Ce modèle repose sur la deuxième loi de Fick et prend en compte l'encombrement stérique au sein du réseau de gélatine. Ainsi, il est possible de prévoir la diffusion en fonction de la nature du réseau et de la molécule diffusante.Enfin les résultats ont été utilisés dans le but de développer un pansement actif permettant de stimuler la cicatrisation des plaies chroniques.Gels are soft matter composed of a liquid phase entrapped in a polymer network. Biopolymers can form gels, and then called biogels. Biocompatible, bioresorbable, these structures are really closed to extracellular matrix. Furthermore, aqueous phase represents 95% of the whole gel. Its possible to include molecules inside this liquid phase. Molecules are then released from the gel to the external environment.During this PhD project, we have studied the molecular release from different gelatin matrices.First, the release of a large range of molecules from chemical gelatin gel was studied. Different molecular weights and ionic charges were compared. The results show that the release depend on both the network structure and the include molecule characteristics. Moreover, the simultaneous release of two different compounds is possible.In the second part of the manuscript, gelatin gel was modified in order to control or stimulate the release. Five matrices were synthesised and tested. At first, alginate, a viscous polymer was introduced into the aqueous phase. Alginate is able to limit diffusion and its hydrolysis stimulates molecular release. Then, the gelatin network itself was modified. The synthesis of a second network within gelatin gel increases the entrapment of molecules. On the contrary, the use of ephemeral gels, where gelatin network hydrolysis is programmed and timed-controlled, leads to stimulate the molecular release.Then, a simple model elaborated from Fick's second law was constructed to describe these different delivery systems. The originality of the model resides in the consideration of the steric hindrance inside the gel. This unique model is able to predict correctly the release kinetics of small and large molecules, with or without interaction with the solid network, the concomitant release of two molecules and the release from ephemeral gels.Finally, all results were used in order to develop a new wound dressing able to deliver drugs and stimulate chronics wound healing.CERGY PONTOISE-Bib. electronique (951279901) / SudocSudocFranceF

Enzyme-catalyzed phase transition of alginate gels and gelatin-alginate interpenetrated networks.

International audienceThe enzyme-catalyzed gel-sol transition of calcium-alginate obtained by internal gelling strategy with the help of an entrapped alginate lyase is described. We show that alginate molecules and enzyme-produced oligoalginates shorten the gel time of physical gelatin gels (5% and 1.5%), probably due to local protein concentration increase. Interpenetrated networks composed of calcium-alginate and of gelatin were obtained only if elongation of gelatin helices inside a pre-existing calcium-alginate network could occur and only for low gelatin concentration (1.5%). The physical gelatin network is almost reversible inside the alginate one. Both networks can be obtained in the presence of alginate lyase, but gel-sol transition of calcium-alginate cannot be obtained in the presence of gelatin

Création de nouveaux biomatériaux Réseaux interpénétrés de Polymères Réseau POE-Réseau Fibrine

L objectif de ce travail à l interface entre ERRMECe (Equipe de Recherche sur les Relations Matrice Extracellulaire-Cellules) et le LPPI (Laboratoire de Physicochimie des Polymères et des Interfaces) était de créer de nouveaux matériaux biocompatibles autosupportés à base de gel de Fibrine. De tels biogels présentent, en effet, des applications potentielles en ingénierie tissulaire. Une première approche consistant en la réticulation du gel de fibrine par la transglutaminase n a pas permis une amélioration suffisante des propriétés visco-élastiques du gel. Une alternative a donc été d associer à un réseau de fibrine, un réseau de poly(oxyde d éthylène) (réseau POE) au sein d une architecture de réseaux interpénétrés de polymères (RIP). Le réseau de fibrine est formé par hydrolyse enzymatique du fibrinogène catalysée par la thrombine. Le réseau POE est, quant à lui, réalisé par photoréticulation d oligomère poly(oxyde d éthylène) diméthacrylate (PEGDM) amorcée par l Irgacure 2959. Le premier RIP est (RIP 550-5) élaboré à partir d une solution contenant du PEGDM de masse molaire 550 g/mol à une concentration de 100 mg/mL et de fibrinogène à une concentration de 5 mg/mL dans du tampon Tris. Les différentes analyses (IR, DSC, Electrophorèse, ) montrent que, dans les conditions de synthèse mises au point, les deux réseaux se forment bien l un en présence de l autre. Le module de conservation du gel de fibrine augmente d une centaine de pascals dans le gel de fibrine au mégapascal dans ce RIP 550-5. L objectif d améliorer les propriétés visco-élastiques du réseau de fibrine est donc atteint. De plus, le matériau est manipulable et possède de bonnes propriétés de réversibilité à la déshydratation. La modification de ce RIP 550-5 a ensuite été entreprise. En fonction de la proportion de fibrinogène, de la masse molaire du PEGDM et de l action concertée ou antagoniste des enzymes présentes, thrombine et transglutaminase, la nature et les propriétés des RIP obtenus varient offrant ainsi une gamme de nouveaux matériaux biocompatibles. Ce travail représente une approche novatrice tant dans le domaine des biomatériaux que dans celui de l enzymologie.This PhD project realized in close collaboration between a biochemistry team (ERRMECe - Equipe de Recherche sur les Relations Matrice Extracellulaire-Cellules), and a polymer laboratory (LPPI - Laboratoire de Physicochimie des Polymères et des Interfaces) was to create new biocompatible and handling materials based on fibrin gels for potential applications in tissue engineering. First, fibrin gels were cross-linked with an enzyme, transglutaminase, but it did not improve viscoelastic properties enough. A poly (ethylene glycol) network (POE network) was thus associated to the fibrin network into an interpenetrating polymer network architecture (IPN). The fibrin network is formed through a sol-gel transition induced by a fibrinogen enzymatic hydrolysis catalysed by thrombin. The POE network is synthesized by poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDM) oligomer cross-linking reaction initialized by Irgacure 2959 under UV radiations. A first IPN (named IPN 550-5) was elaborated from a pH 7.4 Tris buffer solution containing 100 mg/mL PEGDM (molar mass of 550 g/mol) and 5 mg/mL fibrinogen. Different complementary analyses (IR, DSC, electrophoresis, ) showed that the two networks are generated one in presence of the other. In addition, the storage modulus is increased from one hundred Pascal for fibrin gel to one megapascal for IPN 550-5 both in a wet state. The improvement of fibrin network viscoelatic properties was thus achieved. In addition, the material is handling and shows good (re)hydration properties. Thus, the process was extended to other conditions. Varying the quantity of each polymer, the molecular mass of the synthetic polymer and controlling the concerted or antagonistic action of the used enzymes (thrombin and transglutaminase) result in the obtaining of different materials. This work represents a new approach in both biomaterials and enzyme fields.CERGY PONTOISE-BU Les Cerclades (951272104) / SudocSudocFranceF

CHARACTERIZATION OF THE EFFECT OF HEAT ON VEGETABLE TANNED LEATHER

International audienceFunded by the LabEx PATRIMA, this project combines the expertise of the CRCC laboratory, in physical chemistry and the ERRMECe laboratory in biology and biochemistry. The research aims to develop a new restoration approach for leather having lost its flexibility as a result of alteration, in particular after exposure to heat. This innovative method relies on the use of biological molecules to respect the nature of the object and preserve its past and future.Our hypothesis is that exposure to heat causes a protein aggregation. To validate this hypothesis and develop the restoration method, the modifications taking place in the leather structure are examined at different scales

Characterization of Breast Implant Surfaces, Shapes, and Biomechanics: A Comparison of High Cohesive Anatomically Shaped Textured Silicone, Breast Implants from Three Different Manufacturers

International audienc

CHARACTERIZATION OF THE EFFECT OF HEAT ON VEGETABLE TANNED LEATHER AND RESTORATION TRIALS THROUGH ENZYMATIC PROCESSES

International audienceThe research aims to develop a new restoration approach for leather in cultural heritage having lost its flexibility after exposure to heat. This innovative method relies on the use of biological molecules in order to respect the nature of the object and preserve its past and future. To confirm the protein aggregation expected after exposure to heat, the leather was first characterized by different techniques; then the innovative restoration approach was tested.The characterization of heat-damaged leather was performed by both physico-chemical (DMA, TGA, contact angle measurement, SEM) and biochemical (Protein extraction, Protein assays, Western-Blot) methods.Heat induces darkening, mass loss, shrinkage, stiffness increase and renders leather non wettable. Part of these changes can be due to an aggregation of leather proteins as a result of heat exposure as also shown by sequential protein extraction. Thanks to this new information, a biochemical restoration approach using enzymatic hydrolases aiming to break the protein aggregates has been developed. One of the challenges was to provide water for the enzyme without wetting the leather surface so to avoid further damage of the leather. Several procedures were tested and compared, and encouraging results were obtained