Epigenetic control of TLR4-mediated gene expression induced by bacteria and bacterial cell wall components in human intestinal epithelial cells

Hintergrund: Kommensale Bakterien und bakterielle Zellwandbestandteile können über diverse intrazelluläre Signalwege komplexe Zellreaktionen hervorrufen. Beispielsweise scheinen LPS und probiotische Bakterien DNA-Methylierung zu modifizieren und somit Veränderungen der Genexpression mittels epigenetischer Mechanismen zu steuern. Methoden: In der vorliegenden in vitro Studie wurden intestinale Epithelzellen (Caco-II-Zellen) mit LPS, Flagellin, Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Lactobacillus delbrueckii (LD) stimuliert und daraufhin die mRNA Level in den Entzündungsprozess involvierter Gene (TNFα, TLR4, p38) und miRNAs (146a, 155) mit Hilfe von q-PCR gemessen. Des Weiteren wurde die DNA-Methylierung von 4 CpG loci in der TNFα-Promotorregion und 4 CpGs des TLR4 Exons mittels Pyrosequenzierung quantitativ bestimmt. Ergebnisse: Stimulation mit LPS, Flagellin, LGG und LD resultierte jeweils in einer Abnahme der mRNA Level von TNFα und TLR4, während p38 mRNA leicht anstieg. Die Behandlung mit Flagellin löste eine 4,42±0,51-fache (p=0,002) Zunahme der miRNA-146a aus, hatte aber keinen Einfluss auf die miRNA-155. Die DNA-Methylierung der vier analysierten TNFα CpG loci bewegte sich zwischen 70-90%. Signifikante Veränderungen der TNFα-Methylierung wurden durch LGG nach 12 Stdn. (+1,07%±0,24, p=0,048), LD nach 24 Stdn. (+1,54%±0,3, p=0,035) und LPS nach 72 Stdn. (-0,58%±0,05, p=0,007) verursacht. TLR4-Methylierungen schwankten zwischen 10-45% in den unterschiedlichen Zellexperimenten. CpG 4 zeigte eine signifikante Zunahme nach 12 Stdn. Behandlung mit LPS (+2,00%±0,42, p=0,041), CpG 3 eine Abnahme nach 72 Stdn. Behandlung mit LGG (-1,77%±0,29, p=0,027) und CpG 2 eine Abnahme nach 12 Stdn. LPS Behandlung (-1,62%±0,26, p=0,024). 12 stündige Stimulation der Zellen mit LGG führte bei TNFα zu einer Zunahme in Methylierung bei gleichzeitiger Abnahme der mRNA Level. Schlussfolgerung: Die Resultate dieser Studie lassen darauf schließen, dass die epigenetische Regulation von TNFα und TLR4 zu der Spezifität der inflammatorischen Reaktionen beiträgt, welche durch Bakterien und deren Zellwandbestandteile ausgelöst werden.Background: Commensal bacterial strains and bacterial cell wall components are proposed to induce differential cell responses regulated by intracellular signalling pathways. Epigenetic modulation of gene expression via DNA methylation was recently discussed to be influenced by LPS and probiotic bacteria. Methods: We analysed the expression of inflammation-relevant genes (TNFα, TLR4, p38) and miRNAs (146a, 155) in caco-II-cells upon stimulation with LPS, flagellin, Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and Lactobacillus delbrueckii (LD) by measuring mRNA levels with q-PCR. Furthermore, DNA methylation of four CpG loci in the TNFα promoter region and four CpGs of the TLR4 exon was measured by using bisulfite-converted DNA for pyrosequencing analysis. Results: LPS, flagellin, LGG and LD each decreased mRNA levels of TNFα and TLR4, while p38 mRNA was slightly increased by each treatment. Flagellin induced miRNA-146a expression by 4.42-fold±0.51 (p=0.002), but did not alter miRNA-155. Methylation of four analysed TNFα CpG loci ranged between 70-90% in un-stimulated cells. Significant changes in TNFα methylation over all four CpGs were caused by LGG after 12h of stimulation (+1.07%±0.24, p=0.048), LD after 24h (+1.54%±0.3, p=0.035) and LPS after 72h (-0.58%±0.05, p=0.007). TLR4 methylation ranged between 10 and 45% in different CpGs and cell culture experiments. CpG 4 was significantly increased by 12h LPS treatment (+2.00%±0.42, p=0.041), CpG 3 was decreased after 72h LGG treatment (-1.77%±0.29, p=0.027) and CpG 2 was also decreased after 12h LPS treatment (-1.62%±0.26, p=0.024). LGG treatment for 12h showed an increase in methylation (+1.07%±0.24, p=0.048) and a decrease in mRNA expression (0.73-fold±0.23, p=0.008) of TNFα. Conclusion: The results indicate, that epigenetic regulation of TNFα and TLR4 contributes to the specificity of inflammatory reactions induced by bacteria and their cell wall components