Charakterisierung neuer Funktionen der mRNA-Exportfaktoren Npl3p und Dbp5p in der Translation

Durch die Kompartimentierung einer eukaryontischen Zelle erfolgen die Genexpression und die Proteinbiosynthese an verschiedenen Orten. Im Zellkern findet die Transkription der Gene in die komplementären prä-mRNA’s statt, die durch die nukleäre Prozessierung zu exportkompetenten mRNA’s reifen. Diese werden dann in Assoziation mit Proteinen als mRNP-Komplexe durch die Kernporenkomplexe (NPC’s) der Zellkernmembran in das Zytoplasma transportiert, wo anschließend die Translation erfolgt. Bei dieser wird der genetische Code der mRNA mit Hilfe der Ribosomen in die Aminosäuresequenz der Proteine übersetzt. An dem mRNA-Export ins Zytoplasma sind zahlreiche mRNA-bindende Proteine beteiligt, von denen ein Großteil unmittelbar nach der Translokation von der mRNA dissoziiert. Im Gegensatz dazu verbleiben einige dieser mRNA-bindenden Proteine, wie die DEAD-Box RNA-Helikase Dbp5p oder das pendelnde SR-Protein Npl3p in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, auch während der Translation an der mRNA. Dies weist auf mögliche Funktionen dieser Proteine in der Translation hin, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Genetische, zellbiologische und biochemische Analysen zeigen, dass Npl3p und Dbp5p in unterschiedlichen Phasen der Translation involviert sind. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch Lokalisationsstudien und Analysen von physikalischen Interaktionen Npl3p als ein neuer Exportfaktor der ribosomalen prä-60S-Untereinheit charakterisiert. Zusätzlich bestätigen identifizierte genetische Interaktionen von NPL3 mit den bereits bekannten Exportfaktoren der prä-60S-Untereinheit, XPO1, MTR2 und NMD3, die Transportfunktion von Npl3p. Des Weiteren führt eine Deletion von NPL3 (npl3Δ) zu einer reduzierten Wachstumsrate, die nicht durch Exportdefekte der prä-60S-Untereinheit, sondern durch Translationsdefekte verursacht wird. Die Translationsdefekte werden durch eine reduzierte Monosomenanzahl (80S) hervorgerufen, die durch eine verringerte Assoziation der 40S-Untereinheit mit der 60S-Untereinheit beim finalen Schritt der Translationsinitiation, dem Subunit Joining, entstehen. Dies verdeutlichen sowohl genetische als auch physikalische Interaktionen von NPL3 bzw. Npl3p mit Faktoren, die am Prozess des Subunit Joinings beteiligt sind. Weitere Untersuchungen zeigen, dass Npl3p über seinen Carboxyterminus Homodimere oder Homooligomere ausbilden kann. Demzufolge könnte die Verknüpfung beider mRNP’s bei der Assemblierung des 80S-Ribosoms nach dem Npl3p-vermittelten Export der mRNA und der prä-60S-Untereinheit in das Zytoplasma über diese Npl3p-Npl3p-Interaktion erfolgen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine aktive Funktion von Dbp5p bei der Translationstermination charakterisiert. Eine generelle Funktion von Dbp5p während der Translation wird durch das schlechtere Wachstum von dbp5-Mutanten in Anwesenheit von Translationsinhibitoren ersichtlich. DBP5 interagiert genetisch sowohl mit beiden Translationsterminationsfaktoren SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3), als auch mit dem poly(A)-bindenden Faktor PAB1. In Reporterversuchen wird deutlich, dass die katalytische Aktivität von Dbp5p für die effiziente Erkennung des Stopp-Kodons durch Sup45p (eRF1) erforderlich ist. Des Weiteren interagiert Dbp5p physikalisch mit Sup45p (eRF1), jedoch nicht mit Sup35p (eRF3) oder Pab1p. In dbp5-Mutanten ist die Ko-Sedimentation von Sup35p (eRF3) mit Polysomen erheblich reduziert und die Assoziation von Sup45p (eRF1) mit Sup35p (eRF3) verhindert. Daher scheint Dbp5p die Rekrutierung von Sup35p in den Terminationskomplex zu kontrollieren. Weitere Experimente zeigen, dass Dbp5p die Interaktion von Sup45p und Sup35p ausschließlich bei der regulären Translationstermination, nicht jedoch im Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurden für die beiden mRNA-Exportfaktoren Npl3p und Dbp5p neue Funktionen in der Translation identifiziert und näher charakterisiert, so dass ersichtlich wird, dass diese Proteine die beiden Prozesse, mRNA-Export und Translation, miteinander verbinden. Dies offenbart zum einen die Multifunktionalität dieser Proteine. Zum anderen zeigt die Verwendung derselben Proteine in den beiden Prozessen die effiziente Regulation in einer eukaryontischen Zelle

Analysen des SR-Proteins Npl3 in der Translation und Charakterisierung von SR-Domänen-vermittelten Protein-Interaktionen von Npl3

Im Gegensatz zu vielzelligen Organismen existieren in Saccharomyces cerevisiae nur drei SR-Proteine. Diese fungieren als pendelnde Adapterproteine im nukleo-zytoplasmatischen Transport von mRNAs. Ein wichtiger Vertreter ist Npl3, welches auch mit aktiv translatierten mRNPs (messenger ribonucleoproteins) assoziiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Npl3 neben der Funktion des mRNA-Exports in das Zytoplasma in weiteren Prozessen eine Bedeutung hat. So konnte dazu beigetragen werden Npl3 als Prä-60S-Exportfaktor zu identifizieren. Außerdem konnte nachgewiesen werden, daß Npl3 über den Export und die zytoplasmatische Reifung hinaus mit dem Rpl10-haltigen 60S-Partikel assoziiert. Somit besitzt Npl3 das Potential über die Bindung an translationskompetente 60S-Untereinheiten die Translation zu beeinflussen. Tatsächlich konnte die vorliegende Studie eine verringerte Translationseffizienz in Hefezellen als Folge einer Verkürzung der SR-Domäne von Npl3 zeigen. Dagegen stellten sich der mRNA- und der Prä-60S-Export aus dem Zellkern sowie die zytoplasmatische Reifung des 60S-Partikels unbeeinträchtigt dar. Zusätzlich wiesen die Ergebnisse darauf hin, daß eine generelle Methylierung bzw. die Phosphorylierungsstelle an Position 411 in der SR-Domäne von Npl3 nicht essentiell für die Translation ist. Vielmehr bedingt die Verkürzung der SR-Domäne eine gestörte Bindung von Npl3 an das translationskompetente 60S-Partikel und daraus folgernd eine Störung der Monosomenformation in der Translationsinitiation. Dieser Defekt in der Monosomenbildung beruht auf einer ineffizienten Bindung von 60S-Partikeln an mRNA-rekrutierte 43S-Initiationskomplexe. Verschiedene Suppressionsexperimente und genetische Analysen in dieser Arbeit legen eine Rolle von Npl3 in Prozessen nahe, die mit den Funktionen von Rpl10 und Fun12 assoziiert sind. Des weiteren konnte eine Homomer-Bildung von Npl3-Molekülen nachgewiesen werden, welche vom N-terminalen Bereich der SR-Domäne abhängig ist. Zusätzlich demonstrierten Ko-Immunopräzipitations- und Immunfluoreszenz-Experimente, daß dieser Domänenbereich von Npl3 im Wesentlichen auch für die Bindung des Zellkernimportrezeptors Mtr10 entscheidend ist. Weitere Ergebnisse deuteten darauf hin, daß sich die Homomer-Bildung von Npl3 positiv auf die Translationsinitiation auswirkt. Demnach kann vorliegende Arbeit Npl3, und insbesondere seiner SR-Domäne, eine essentielle Aufgabe für die Translation zuweisen und lässt dabei auf eine Funktion von Npl3 im Prozess der Monosomenbildung während der Translationinitiation, wie auch im letzten zytoplasmatischen Reifeschritt des Prä-60S-Partikels schließen

Identifizierung von neuen Faktoren des Gbp2-assoziierten mRNA-Exportes und den Untersuchungen an mRNA-bindenden Proteinen im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae.

Die räumliche und zeitliche Trennung von RNA- und Proteinsynthese in eukaryotischen Zellen bietet eine Menge Möglichkeiten für Kontrolle und Regulation dieser Vorgänge. Gleichzeitig erfordert dies eine funktionierende Maschinerie, die den korrekten Ablauf beider Prozesse und den Transport zwischen den Kompartimenten regelt. Fehler in diesen Abläufen führen unter anderen zu neurodegenerativen Krankheiten und hämatologischen und soliden Tumoren. Viele dieser Prozesse sind hochkonserviert und konnten durch Arbeiten an dem Modellmechanismus Saccharomyces cerevisiae besser verstanden werden. In dieser Arbeit werden verschiedene, mRNA-bindende und zwischen beiden Kompartimenten pendelnde Proteine in S. cerevisiae charakterisiert. Dabei wurde unter Verwendung einer zytoplasmatischen Variante des SR-ähnlichen Proteins Gbp2 (gbp2(S15A)-GFP) nach Exportfaktoren gesucht, die den Export Gbp2 assoziierter mRNAs beeinflussen. 33 durch EMS-Mutagenese erzeugte, temperatur-sensitive Mutanten wurden untersucht. Es konnten dabei das mit dem TRAMP-Komplex assoziierte Protein Mtr4 und der Spleißingfaktor Prp8 als Faktoren identifiziert werden. GBP2 ist nicht essentiell, allerdings ist eine Überexpression von GBP2 toxisch und führt zu einer nukleären Akkumulation von poly(A)+-RNA. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Toxizität unabhängig von der Lokalisation in beiden Zellkompartimenten ist, da sowohl die zytoplasmatische Variante (gbp2(S13/15/17A)) als auch das vorwiegend nukleär lokalisierte Gbp2 in Überexpression toxisch sind. Gbp2 ist daher möglicherweise bei Prozessen auf beiden Seiten der Kernmembran beteiligt. In der Tat konnten anderen Arbeiten nachweisen, dass Gbp2 im Zellkern ein wichtiger Kontrollfaktor für fehlerhaft gespleißte mRNAs ist und dass dafür die Assoziation sowohl mit Spleißingfaktoren als auch mit dem TRAMP-Komplex wichtig ist. Nab2 ist ein essentielles, mRNA-bindendes, pendelndes Protein, dass mit dem mRNA-Exportfaktor Mex67 interagiert. Der in dieser Arbeit hergestellten Mutante (nab2Δ200-249) fehlt die Bindestelle für den Importrezeptor Kap104. Diese Mutante kann einen temperatursensitiven Defekt von NAB2 (nab2-21) nicht ersetzen. Des Weiteren zeigte diese Mutante im Gegensatz zu Nab2 eine vorwiegend zytoplasmatische Lokalisation, da vermutlich der Import der Mutante durch das Fehlen der Kap104-Bindestelle eingeschränkt ist. Mittels Lokalisationsstudien dieser Nab2-Variante in verschiedenen Mutationsstämmen konnte gezeigt werden, dass der Export von nab2Δ200-249, von funktionierendem mRNA Export abhängt, allerdings ist eine Ubiquitinierung durch Tom1 für den Export von nab2Δ200-249 im Gegensatz zu Nab2 keine Voraussetzung