Philipps-Universität Marburg, Molekularbiologie und Tumorforschung
Doi
Abstract
Durch die Kompartimentierung einer eukaryontischen Zelle erfolgen die Genexpression und die Proteinbiosynthese an verschiedenen Orten. Im Zellkern findet die Transkription der Gene in die komplementären prä-mRNA’s statt, die durch die nukleäre Prozessierung zu exportkompetenten mRNA’s reifen. Diese werden dann in Assoziation mit Proteinen als mRNP-Komplexe durch die Kernporenkomplexe (NPC’s) der Zellkernmembran in das Zytoplasma transportiert, wo anschließend die Translation erfolgt. Bei dieser wird der genetische Code der mRNA mit Hilfe der Ribosomen in die Aminosäuresequenz der Proteine übersetzt. An dem mRNA-Export ins Zytoplasma sind zahlreiche mRNA-bindende Proteine beteiligt, von denen ein Großteil unmittelbar nach der Translokation von der mRNA dissoziiert. Im Gegensatz dazu verbleiben einige dieser mRNA-bindenden Proteine, wie die DEAD-Box RNA-Helikase Dbp5p oder das pendelnde SR-Protein Npl3p in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, auch während der Translation an der mRNA. Dies weist auf mögliche Funktionen dieser Proteine in der Translation hin, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Genetische, zellbiologische und biochemische Analysen zeigen, dass Npl3p und Dbp5p in unterschiedlichen Phasen der Translation involviert sind. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch Lokalisationsstudien und Analysen von physikalischen Interaktionen Npl3p als ein neuer Exportfaktor der ribosomalen prä-60S-Untereinheit charakterisiert. Zusätzlich bestätigen identifizierte genetische Interaktionen von NPL3 mit den bereits bekannten Exportfaktoren der prä-60S-Untereinheit, XPO1, MTR2 und NMD3, die Transportfunktion von Npl3p. Des Weiteren führt eine Deletion von NPL3 (npl3Δ) zu einer reduzierten Wachstumsrate, die nicht durch Exportdefekte der prä-60S-Untereinheit, sondern durch Translationsdefekte verursacht wird. Die Translationsdefekte werden durch eine reduzierte Monosomenanzahl (80S) hervorgerufen, die durch eine verringerte Assoziation der 40S-Untereinheit mit der 60S-Untereinheit beim finalen Schritt der Translationsinitiation, dem Subunit Joining, entstehen. Dies verdeutlichen sowohl genetische als auch physikalische Interaktionen von NPL3 bzw. Npl3p mit Faktoren, die am Prozess des Subunit Joinings beteiligt sind. Weitere Untersuchungen zeigen, dass Npl3p über seinen Carboxyterminus Homodimere oder Homooligomere ausbilden kann. Demzufolge könnte die Verknüpfung beider mRNP’s bei der Assemblierung des 80S-Ribosoms nach dem Npl3p-vermittelten Export der mRNA und der prä-60S-Untereinheit in das Zytoplasma über diese Npl3p-Npl3p-Interaktion erfolgen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine aktive Funktion von Dbp5p bei der Translationstermination charakterisiert. Eine generelle Funktion von Dbp5p während der Translation wird durch das schlechtere Wachstum von dbp5-Mutanten in Anwesenheit von Translationsinhibitoren ersichtlich. DBP5 interagiert genetisch sowohl mit beiden Translationsterminationsfaktoren SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3), als auch mit dem poly(A)-bindenden Faktor PAB1. In Reporterversuchen wird deutlich, dass die katalytische Aktivität von Dbp5p für die effiziente Erkennung des Stopp-Kodons durch Sup45p (eRF1) erforderlich ist. Des Weiteren interagiert Dbp5p physikalisch mit Sup45p (eRF1), jedoch nicht mit Sup35p (eRF3) oder Pab1p. In dbp5-Mutanten ist die Ko-Sedimentation von Sup35p (eRF3) mit Polysomen erheblich reduziert und die Assoziation von Sup45p (eRF1) mit Sup35p (eRF3) verhindert. Daher scheint Dbp5p die Rekrutierung von Sup35p in den Terminationskomplex zu kontrollieren. Weitere Experimente zeigen, dass Dbp5p die Interaktion von Sup45p und Sup35p ausschließlich bei der regulären Translationstermination, nicht jedoch im Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurden für die beiden mRNA-Exportfaktoren Npl3p und Dbp5p neue Funktionen in der Translation identifiziert und näher charakterisiert, so dass ersichtlich wird, dass diese Proteine die beiden Prozesse, mRNA-Export und Translation, miteinander verbinden. Dies offenbart zum einen die Multifunktionalität dieser Proteine. Zum anderen zeigt die Verwendung derselben Proteine in den beiden Prozessen die effiziente Regulation in einer eukaryontischen Zelle