Primjena kulture stanica prednjeg režnja hipofize u toksikološkim istraživanjima

High density plating procedure was used to evaluate the effect of atrazine on anterior pituitary cells of rats in monolayer culture. Collagenase-dispersed pituitary cells plated in suspension with medium-199 and 10% foetal calf serum attached quantitatively to plastic surfaces within 24 hours. Electron microscopy showed subpopulations of different cell types. After prolonged cultivation, most cells established small colonies with extensive contacts among them. Cell-to-cell formation of aggregates was significant and the colonies manifested morphological changes. The cells retained their enzymatic activity, converting testosterone into 5alfa-dihydrotestosterone by enzyme 5alfa-reductase. Immunohistochemical techniques facilitated differentiation of gonadotrophs producing follicle stimulating (FSH) and luteinising hormones (LH). Atrazine in concentrations of 5 to 50 µg/ml of medium was associated with a significant reduction in the number of viable cells within 72 hours. The results suggest that the pituitary cell culture may prove useful in toxicological testing of various toxic compounds and reduce or replace in vivo animal experiments.Atrazin, selektivni s-triazinski herbicid, danas se rabi u velikim količinama za zaštitu kukuruznih polja, a zbog svoje liposolubilnosti i perzistentnosti u okolišu ulazi u hranidbeni lanac. In vitro sustavi tkiva i organa sisavaca uz in vivo pokuse još i danas su pretežite tehnike u toksikologiji koje se pouzdano primjenjuju. Potrebe za smanjenjem broja pokusa na životinjama dovele su do intenzivna razvoja tehnika sa životinjskim stanicama, bilo da se radi o primarnim kulturama ili o staničnim linijama. Primarne kulture stanica središnjega živčanog sustava nisu do danas doživjele punu primjenu. Primjena životinjskih stanica mnogo je jeftinija tehnika koja omogućuje provođenje istodobnog ispitivanja na velikom broju uzoraka. Cilj istraživanja bio je ispitati toksičnost atrazina u in vitro uvjetima na modelu kulture stanica hipofize, koje su odgovorne za normalno funkcioniranje reprodukcijskog procesa. U radu se dobrom izolacijskom metodom i visokim stupnjem uspješnog uspostavljanja kulture stanica, mogao pratiti utjecaj atrazina na razini staničnih promjena. Stanice raspršene kolagenazom u suspenziji s medijem 199 i 10%-tnim telećim serumom prihvatile su se za plastičnu podlogu unutar 24 sata. Elektronskom mikroskopijom nađeni su različiti tipovi stanica. Nakon produljene kultivacije, najveći broj stanica stvorio je male kolonije s uočljivim vezama između stanica. Stanice su pokazale dobru enzimsku aktivnost pri pretvorbi testosterona u aktivni metabolit 5alfa-dihidrotestosteron. Imunohistokemijskim metodama utvrđene su stanice koje sintetiziraju hormone što stimuliraju razvoj folikula (FSH) i hormone luteinizacije (LH). Atrazin je dodan kulturi stanica hipofize u koncentracijama 5–50 µg/ml medija koji je sadržavao 3x105 stanica. Tijekom 24, 48 i 72 sata nađena su značajna smanjenja broja živih stanica, od 36 do 46%. Učinci su ovisili o dozi atrazina. Rezultati upućuju na to da se kulture stanica adenohipofize mogu uspješno rabiti u budućim istraživanjima toksičnosti različitih tvari radi smanjenja ili zamjene in vivo pokusa na životinjama

Alternativni modeli ispitivanja toksičnosti ksenobiotika

The alternatives to whole-animal testing include endpoint assays, cell and tissue cultures, use of tissue slices, toxicokinetic modelling, and structure-activity relationships and databases. The use of in vitro systems (subcellular fractions, cell lines, primary cell cultures, tissue slices, organ cultures, etc.) as research tools in toxicology is widespread. In the past few years, the apoptosis phenomena were followed by very precise intracellular changes where, through programmed cell death, a cell can be removed from a population. The in vitro systems are ideally suited for investigations of the molecular, cellular and physiological mechanisms of chemically induced toxicity, which cannot readily be studied in vivo for known target organ and target species toxicity studies and for answering specific questions about toxic effects. The main justification for developing in vitro toxicity tests is that they will make toxicology a more scientifically based practice. It is increasingly apparent that the development and incorporation of stepwise testing strategies, combining experimental data from a range of alternative methods (physicochemical techniques, quantitative structure-activity relationships - QSAR, metabolic and kinetic modelling and in vitro tests), provide the most advanced way to predict toxicity, reducing at the same time the number of laboratory animals used for testing.Alternativni sustavi ispitivanja toksičnosti na životinjama obuhvaćaju postupke koji uključuju stanice i kulture, uporabu dijelova tkiva, toksikokinetičko modeliranje, kao i odnose aktivnosti prema strukturi ksenobiotika. Uporaba in vitro sustava (staničnih frakcija, staničnih linija, primarnih staničnih kultura, dijelova tkiva, kulture organa itd.) ima široku primjenu u toksikološkim istraživanjima. U posljednjih nekoliko godina fenomen apoptoze može se pratiti prema vrlo preciznim unutarstaničnim promjenama te utvrđena programirana smrt stanice iskoristiti u uklanjanju takvih stanica iz populacije. In vitro sustavi idealno se rabe u istraživanjima molekularnih, staničnih i fizioloških mehanizama toksičnosti izazvanih kemikalijama, dok in vivo studije toksičnosti ne mogu dati te odgovore. Glavna potvrda razvoja i praćenja toksičnosti spojeva u in vitro testovima jest znanstvena utemeljenost toksikologije. Razvoj i uvođenje strategija testiranja koje primjenjuju kombinaciju eksperimentalnih podataka iz niza alternativnih metoda (fizikalno-kemijske tehnike, QSAR tehnike, metaboličko i kinetičko modeliranje) omogućuje najefikasniju procjenu toksičnosti, kao i istodobno smanjenje broja laboratorijskih životinja potrebnih u postupcima testiranja toksičnosti spojeva

Učinci lindana na reprodukcijske pokazatelje u štakora.

The effects of lindane (γ-1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane) on male reproductive parameters were studied in sexually mature rats. Epididymal sperm numbers and motility, as well as α-glucosidase activity in the epididymis, were determined after i.p. treatment of lindane at concentrations of 9 and 18 mg kg-1 body wt, twice a week for 60 days. The values of epididymal sperm numbers were significantly lower (P<0.001) in the animals treated with both doses compared to the control values. Sperm numbers decreased by 42% after treatment with the lower lindane dose, while the drop in sperm count in the animals exposed to the higher dose extended to about 50%. In addition, dose-related changes in epididymal sperm motility were detected in lindane-treated animals. Motility decreased by about 45% to 68% at 9 and 18 mg kg-1 body mass, respectively. Relative organ masses (epididymis, prostate, anterior pituitary and testis) were measured at the end of the treatment. A significant decrease (P<0.01) in prostate weight was detected in both groups treated, while the weight of the pituitary decreased (P<0.05) only in the animals treated with the higher dose. α-Glucosidase activity in the epididymides did not show any statistically significant change after exposure to lindane. A histopathological analysis of testicular tissue from treated rats showed cell disorganization. Cells were irregularly shaped, with marked intercellular space between the spermatogenic cells. Our results imply that organochlorine insecticides like lindane can cause reproductive disorders, and therefore more attention should be directed towards understanding the affects of persistent pesticide residues on reproductive outcomes.Učinci lindana (γ-1,2,3,4,5,6-heksaklorocikloheksan) na reprodukcijske pokazatelje istraživani su u spolno zrelih štakora. Broj i pokretljivost spermija, te aktivnost α-glukozidaze u epididimisu određivani su nakon i.p. primjene lindana u koncentracijama od 9 i 18 mg kg-1 tjelesne mase dvaput tjedno tijekom 60 dana. U usporedbi s kontrolnim vrijednostima broj spermija u epididimisu značajno je bio smanjen (P<0,001) u obje lindanom obrađene skupine životinja. Nakon davanja manje doze broj spermija je bio niži za 42%, dok je kod više doze smanjenje iznosilo oko 50%. Također su u pokretljivosti spermija utvrđene promjene ovisno o dozi lindana. Smanjenje pokretljivosti iznosilo je 45%, odnosno 68% uz primijenjene doze od 9 i 18 mg kg-1 tjelesne mase. Relativne mase organa (epididimis, prostata, hipofiza i testis) mjerene su po završetku obrade. Značajno smanjenje težine prostate (P<0,01) utvrđeno je u obje obrađene skupine, dok je težina hipofize bila smanjena (P<0,05) samo uz višu dozu lindana. Izloženost lindanu nije prouzročila statistički značajne promjene aktivnosti α glukozidaze u epididimisu. Patohistološka analiza tkiva testisa pokazala je propadanje stanica. Stanice su poprimile nepravilne oblike uz dosta međustaničnog prostora između spermatogenih stanica. Ovi rezultati pokazuju da organoklorirani insekticidi poput lindana mogu izazvati reprodukcijske poremećaje, te da je potrebno više pažnje usmjeravati razjašnjenju učinaka ostataka postojanih pesticida na reprodukcijske ishode

Organochlorinated insecticides – mechanisms of toxic action

Organoklorovi insekticidi spadaju u skupinu teško razgradivih pesticida. Temeljni mehanizmi djelovanja većine insekticida iz ove skupine su izraženi kao stimulacija centralnog živčanog sustava do koje dolazi uslijed anti-GABA-ergičkog efekta, a dodatno mnogi od njih inhibiraju specifične ATP-aze u neuronima. To su derivati alifatskih ili aromatskih ugljikovodika, vrlo otporni na biorazgradnju, koji se obzirom na kemijsku strukturu dijele na klorirane ciklodiene, insekticide strukture i djelovanja sličnih DDT-u, heksaklorcikloheksane te toksafen. Fizikalno-kemijska svojstva kao kemijska stabilnost i izraziti lipofilni karakter doprinose njihovoj progresivnoj kumulaciji posebno u masnim tkivima pojedinih životinja ili biljakama u hranidbenom lancu, te time predstavljaju veliku opasnost za čovjeka. Unatoč tome što je danas upotreba mnogih spojeva iz ove skupine potpuno ili djelomično zabranjena, njihove ostatke nalazimo dozama gotovo svakodnevna. Posebnu opasnost predstavlja činjenica da se mogu prenijeti na novorođenčad dojenjem, ali i umanjiti plodnost te odrediti demografski pad nekih populacija. Molekularni mehanizmi toksičnosti organoklorovih insekticida uključuju promjenu signalnih puteva u stanici kao poslijedicu endokrine modulacije i/ili oksidacijskog stresa. Dokazani su njihovi brojni štetni učinci na zdravlje ljudi kao što je neurotoksičnost, imunotoksičnost, ometanje endokrine homeostaze, toksičnosti na reprodukcijski sustav te karcinogeni potencijal. Povećana potrošnja pesticida, pa tako i organoklorovih insekticida, koja pored određenih korisnih efekata, izaziva i smanjenje kvalitete okoliša zahtjeva stalni nadzor uporabe, točnu prosudbu o toksičnosti svakog pojedinog spoja te ugradnju toksikoloških studija u zakonske propise o dozvoljivim koncentracijama u hrani, čime je moguće postići kontrolu i restrikcije pri primjeni. Ovaj rad donosi analizu mehanizama insekticidnog djelovanja te pregled štetnih učinaka po ljudsko zdravlje.Organochlorine insecticides are a group of highly persistent pesticides, derivatives of aliphatic or aromatic hydrocarbons, very resistant to biodegradation. The basic mechanisms of the majority insecticides of this group are expressed as stimulation of central nervous system that occurs due to non-GABAergic effect, and additionally many of them inhibit specific ATPases in neurons. Due to the chemical structure they include chlorinated cyclodienes, DDT-type insecticides, hexachlorocyclohexanes and toxaphene. Physical and chemical properties like chemical stability and outstanding lipophilic character contribute to their progressive cumulation, especially in fatty tissues of certain animals or in plants in the food chain, and thus represent a major threat to humans. These days the use of many compounds belonging to this group is completely or partially forbidden, but their residues are found in food, water and humans which are almost daily exposed to their low sublethal doses. Special risk represents the fact that they can be transferred to breastfeeding infants, but also they are able to reduce fertility and determine a demographic decline of some populations. Molecular mechanisms of toxicity of organochlorine insecticides include alteration of signaling pathways in the cell as a result of endocrine modulation and/or oxidative stress. Numerous adverse effects on human health caused by the exposure to organochlorine insecticides are scientifically proven, such as neurotoxicity, immunotoxicity, disruption of endocrine homeostasis, reproductive system toxicity and carcinogenic potential. Increased consumption of pesticides, including organochlorine insecticides, which in addition to certain beneficial effects, causes reduction of environmental quality, requires constant monitoring of use, accurate judgment on the toxicity of each compound and implementation of the toxicological studies in legislation on allowable concentrations in food, which is achieved by the control and restrictions in application. This article provides analysis of the insecticidal activity mechanisms and a review of the harmful effects on human health

Biotehnologija u Hrvatskoj – povijesna baština i suvremeni trendovi

Razvoj biotehnologije u Hrvatskoj započeo je 1956. godine, osniva-njem jednog od prvih studija biotehnologije u Europi na Sveučilištu u Zagre-bu, na tadašnjem Tehnološkom fakultetu, a danas je to Prehrambeno-bioteh-nološki fakultet (PBF) Sveučilišta u Zagrebu. Osnivanje studija ostvareno je u suradnji s tvrtkom PLIVA koja je tada pokrenula biotehnološku (mikrobnu) proizvodnju antibiotika oksitetraciklina, i do danas je jedna od najvećih far-maceutskih kompanija u Hrvatskoj i jedna od vodećih u regiji Jugoistočne Europe. Prof. emer. Vera Johanides je na temeljima industrijske mikrobiolo- Godišnjak 2019. Akademije tehničkih znanosti Hrvatske 439 gije osmislila, organizirala i pokrenula prvi studij biotehnologije na ovim prostorima. Potpisnica je na osnivačkoj povelji Europske federacije za bio-tehnologiju i jedna je od prvih počasnih članova Akademije tehničkih znano-sti Hrvatske koja joj je postavila spomen obilježje u Domu HATZ-a 2011. godine i njenim imenom nazvala godišnju nagradu HATZ-a za mlade znan-stvenike. Međunarodni znanstveni simpoziji posvećeni prof. emer. Veri Joha-nides, kontinuirano se organiziraju u suradnji HATZ-a i Hrvatskog društva za biotehnologiju. Uz visokoškolsku edukaciju u području biotehnologije, u Hrvatskoj se provode biotehnološka znanstvena istraživanja, kako u akadem-skoj zajednici, tako i na istraživačkim institutima i tvrtkama koje razvijaju vlastite biotehnološke proizvode te na uspostavljenim centrima izvrsnosti u području biotehnologije. Industrijska biotehnološka proizvodnja u Hrvatskoj bazirana je prvenstveno na proizvodnji lijekova, hrane i pića, uključujući akvakulturu i dodatke prehrani, gdje je važna primjena biotehnologije u upravljanju sigurnošću hrane, a raste i proizvodnja biogoriva, i to uglavnom bioplina, te primjena biotehnologije mora i biotehnologije u zaštiti okoliša