腸管寄生原虫類の網羅的検出法の開発と遺伝子情報リファレンスの構築

金沢大学医学系最新のDNAバーコーディング構想を臨床検査に導入して、全ての腸管寄生原虫を特異的かつ網羅的に検出・同定するという新しい検査法の確立を目指し、ヒトに感染し得る6種のEntamoeba属(E.histolytica、E.dispar、E.coli、E.hartmanni、E.polecki、E.moshkovskii)を同定する新規PCR法を確立した。さらに、その有効性を確認すると同時に途上国におけるアメーバ属感染状況の解明を目的に、Entamoeba属の遺伝子型解析を実施した。具体的には、Entamoeba属を網羅的に検出するPCR(網羅的PCR)と種特異的PCRの組み合わせによるnestedおよびsemi-nested PCR法を用い、インドネシアにおいて採取した459検体の糞便サンプルに本法を適用し、糞便から直接抽出したDNAをテンプレートに、Entamoeba属の検出および種同定を実施した。網羅的PCRでは79検体(17.2%)が陽性を示し、その内、E.dispar 6検体(1.3%)、E.coli 62検体(13.1%)、E.hartmanni 38検体(7.6%)、E.polecki 2検体(0.4%)が種同定PCRにより同定された。また、22検体(4.8%)は混合感染だった。以上の結果から、まん延地域では複数の種による重複感染が日常的に起こっており、PCRを用いた検出と分子疫学的解析を実施するには、本法で使用したような各々の種を特異的に検出可能なプライマーが必要であり、有効であることが判明した。したがって、網羅的PCRと特異的PCRを組み合わせた分子系統樹におけるクラスターごとの検出は、DNAバーコーディングを原虫同定に適応していく上で現実的に可能なアプローチであり、今後、その適応範囲を広げていくことが比較的容易と考えられた。研究課題/領域番号:22590377, 研究期間(年度):2010 – 2012出典：研究課題「腸管寄生原虫類の網羅的検出法の開発と遺伝子情報リファレンスの構築」課題番号22590377（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-22590377/）を加工して作

Multiple-subgenotype infections of Giardia intestinalis detected in Palestinian clinical cases using a subcloning approach

金沢大学医薬保健研究域医学系To evaluate the geographic distribution of Giardia intestinalis genotypes in Nablus, West Bank, Palestine, a genotyping study was performed using clinical fecal samples. Microscopic examination confirmed that 8 of 69 (11.6%) samples were G. intestinalis positive, and subsequent genotyping analyses targeting the small-subunit ribosomal RNA (18S rRNA) and glutamate dehydrogenase (GDH) genes revealed the G. intestinalis genotypes within the 8 samples. Of these 8 samples, 6 were clustered with assemblage A-II and the remaining 2 samples were clustered with assemblage B by 18S rRNA gene analysis; however, direct sequencing of the GDH gene segments from the latter 2 samples showed a mixed infection profile. To assess those samples, we employed a subcloning approach and successfully isolated 6 independent assemblage B subgenotypes. These partial GDH gene sequences (393 bp) had 15 single-nucleotide polymorphisms, all of which were synonymous transition substitutions at the third nucleotide position of codons. From the results, we concluded that the highly polymorphic gene loci such as GDH gene locus might provide us an opportunity to obtain a detailed molecular data even from the samples with multiple-subgenotype mixed infections. Therefore, subcloning approach is recommended in genotyping studies, especially in those conducted in giardiasis-endemic areas, where the repeated and cumulative infections could be commonly expected. © 2009 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved

Molecular Characterization of Cryptosporidium Isolates Obtained from Human and Bovine Infections in Japan

Cryptosporidiumポリスレオニン遺伝子のPCR/RFLP分析により、わが国で分離されたヒト由来Cryptosporidium22株は、ヒト型C.parvum(genotype1)、動物型C.parvum(genotype2)、トリ型C.meleagridis(genotype3)の3遺伝子型に明瞭に型別された。ヒト由来genotype3のC.meleagridis分離株は、Cryptosporidium18S　rRNA遺伝子のシークエンス分析により同定され、その存在が本邦で初めて確認された

Helminth Parasites of Bolivian Monkeys

Reports by Grant-in-Aid for Overseas Scientific Survey1986 Grant-in-Aid for Scientific Research (Grant-in-Aid for Overseas Scientific Survey) Reports of Research Project (Number of Project 1984: 59041040, 1985: 60043041)Phylogenetic Studies of South American MonkeysHead Investigator 1984, 1985: Kyoto University, Primate Research Institutc, Professor, Yasuo NOGAMIParasitologic findings in a survey of 19 Bolivian primates belonging to 9 species of 7 genera, 2 Callicebus moloch, l Aotus azarae, 5 Saimiri sciureus, 2 Cebus albifrons, I C. apella, 1 Alouatta seniculus, 3 Saguinus fuscicolis, 3 S. labiatus and I Cebuella pygmaea, are recorded and discussed. Eighteen of 19 animals harbored one or more species of parasites belonging to more than 20 species. New host records noted in this paper are as follows: Callicebus mooch- Longistriata dubia (Nematoda: Heligmosomatidae), Phaneropsolus sp. (Trematoda: Lecithodendriidae, different from P. orbicularis), Bertiella mucronata (Cestoda: Anoplocephalidae), Porocephalus sp. (Pentastomida); Aotus azarae-Trypanoxyuris interlabiata (Nematoda: Oxyuridae), Phaneropsolus sp.; Cebus apella-Longistriata dubia; Saguinus labiatus- Molineus vexiflarius (Nematoda: Trichostrongylidae), Primasubulura jacchi (Nematoda: Subuluridae), Dipetalonemagracile (Nematoda: Dipetalonernatidae), Phaneropsolus orbicularis, Prosthenorchis elegans (Acanthocephala: Gigantorhynchidae); Cebuella pygmaea- Athesmia foxi (Trematoda: Dicrocoeliidae). The pathogenicity of Molineus torulosus, forming tumours in the small intestinal wall of the host animal, is presented

Identification of Genotypes of Giardia intestinalis Isolates from Dogs in Japan by Direct Sequencing of the PCR Amplified Glutamate Dehydrogenase Gene(Parasitology)

Giardia intestinalisは人や動物の下痢症の原因として知られている原虫である.最近の分子生物学的研究により,本種は形態的に区別できない人獣共通寄生性の遺伝子型と人以外の動物から特異に見出される遺伝子型より構成されることが明らかとなっている.犬からは犬に特異的な遺伝子型のみならず人獣共通寄生性の遺伝子型も検出されていることから,遺伝子型を鑑別することは人への感染を予防する上で重要である.本調査では犬からの4分離株について,Giardia glutamate dehydrogenase(GDH)遺伝子のダイレクトシーケンス法により遺伝子型別を行った.著者らが作製したGDH遺伝子を増幅するプライマーペア(GDHF3とGDHB5)は,Giardiaに特異的であり,増幅産物のダイレクトシーケンスから,4株のシーケンスは各々一致することを確認した.また,4株のシーケンスは犬に特異的な遺伝子型Assemblage CあるいはDのシーケンスと15あるいは1塩基対異なっており,GDH遺伝子の系統樹を比較したところ,4株はAssemblage Dのクラスターに分類された.Giardiaの遺伝子型別の報告は国内では今回が最初であり,今回作製したプライマーによるダイレクトシーケンス法は,人獣共通寄生性の遺伝子型と犬に特異な遺伝子型との鑑別に有効な方法と考えられた. Giardia has been detected in domestic dogs in Japan, but the genotype of isolates has remained unclear because identification has relied on conventional microscopy. Here we tried to identify the genotypes of four isolates from dogs in Japan by direct sequencing of the PCR amplified Giardia glutamate dehydrogenase (GDH) gene. The primer pair GDHF3 and GDHB5, targeting the GDH gene, was designed to prime a region of the GDH gene sequence conserved in the strains found to have the dog-specific genotype. The specific PCR product (approximately 220 bp), amplified with this primer pair, was only observed when Giardia DNA was used as the template. The sequences of the diagnostic fragments were identical among the isolates from dogs, and were differed by 15 bp or 1 bp from the strains, which were found to be the dog-specific genotypes, Assemblage C or D respectively. To verify the identity of the amplified DNA, a phylogenetic analysis was performed. Consequently, the sequence of the isolates from dogs clearly clustered with the strain found to be Assemblage D with neighbor-joining analyses. Therefore, all the isolates from dogs examined were identified as the dog-specific genotype, Assemblage D. In the present study, we revealed the genotype of Giardia isolates in Japan, and showed that direct sequencing of the PCR product amplified with the primer pair GDHF3 and GDHB5 was a useful tool for distinguishing between the zoonotic and dog-specific genotypes

ケニア諸地域住民の腸管寄生原虫感染状況

1980年5月から11月の間にケニアのNaivasha，Kitui，M achakos，Taveta及びNandi Hillsの住民2,114人から採取した糞便についてホルマリン・エーテル法により腸管寄生原虫のシストの検査を行い感染状況を調査した。その結果，赤痢アメーパは31.8%， 大腸アメーパは52.3%と極めて高率を示し，その他は小形アメーパ4.8%，ヨードアメーパ8.7%，ランブル鞭毛虫8.3%，メニール鞭毛虫10.4%であった。腸トリコモナス及びEntamoeba hartmanniも少数例検出されたが，大腸パランチジウムやイソスポーラなどは検出されなかった。総陽性率(陽性総数/検査総数)は75.1%にも及び，飲料水，食物など生活環境が糞便によって高度に汚染されていることが示唆された。陽性率に男女聞の有意差は認められなかった。年齢別にみると，4歳以下の乳幼児でもすでにかなり高率に感染がみられるが，ランプノレ鞭毛虫を除き，特に30歳代から40歳代で最高値を示した。ランプル鞭毛虫は若年齢層ほど高い陽性率を示し4歳以下が最高であった。本調査は日本国際協力事業団(JICA)の医療協力「ケニア伝染病研究対策プロジェクト」の一環として行われたものであり，その撲滅対策を，戦後日本で実施され成果をあげた寄生虫予防対策事業との関連において考察した。During the period from May to November in 1980, a total of 2,114 stool specimens were collected from individuals living in Naivasha, Kitui, Machakos, Taveta and Nandi Hills areas in Kenya, and they were examined for intestinal protozoa by formol-ether concentration method followed by idoine-staining. Out of 2,114 specimens 673 (31.8%) were positive for Entamoeba histolytica, 1,105 (52.3%) for Entamoeba coli, 102 (4.8%) for Endolimax nana, 184 (8.7%) for Iodamoeba butschlii, 176 (8.3%) for Giardia lamblia, and 220 (10.4%) for Chilomastix mesnili. The total positive rate, which means the percentage of positive persons for any kinds of intestinal protozoa, was 75.1 per cent