Biochemical Characterization of a Thermostable Adenosylmethionine Synthetase from the Archaeon Pyrococcus Furiosus with High Catalytic Power.

Adenosylmethionine synthetase plays a key role in the biogenesis of the sulfonium compound S-adenosylmethionine, the principal widely used methyl donor in the biological methylations. We report here, for the first time, the characterization of adenosylmethionine synthetase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus (PfMAT). The gene PF1866 encoding PfMAT was cloned and expressed, and the recombinant protein was purified to homogeneity. PfMAT shares 51, 63, and 82% sequence identity with the homologous enzymes from Sulfolobus solfataricus, Methanococcus jannaschii, and Thermococcus kodakarensis, respectively. PfMAT is a homodimer of 90 kDa highly thermophilic with an optimum temperature of 90 °C and is characterized by remarkable thermodynamic stability (Tm, 99 °C), kinetic stability, and resistance to guanidine hydrochloride-induced unfolding. The latter process is reversible as demonstrated by the analysis of the refolding process by activity assays and fluorescence measurements. Limited proteolysis experiments indicated that the proteolytic cleavage site is localized at Lys148 and that the C-terminal peptide is necessary for the integrity of the active site. PfMAT shows kinetic features that make it the most efficient catalyst for S-adenosylmethionine synthesis among the characterized MAT from Bacteria and Archaea. Molecular and structural characterization of PfMAT could be useful to improve MAT enzyme engineering for biotechnological applications

LA S-ADENOSILMETIONINA SINERGIZZZA CON LA DOXORUBICINA NELLA INIBIZIONE PROLIFERATIVA DI CELLULE DI CARCINOMA MAMMARIO ATTRAVERSO L'INDUZIONE DI PROGRAMMI DI MORTE CELLULARE PROGRAMMATA

"La S-adenosilmetionina (indicata con l'acronimo AdoMet o SAM) è uno dei composti più versatili in natura; essa infatti esplica. una serie di azioni biochimiche tra le quali le più note sono quelle relative alla biosintesi delle poliammine e alle reazioni di. transmetilazione (1). In conseguenza dei molteplici e complessi ruoli dell'AdoMet, sono stai attribuiti alla molecola una serie di. effetti farmacologici fra i quali l'azione antiinfiammatoria, antidepressiva e analgesica (1).. . Nell' ultimo decennio è stato dimostrato che la AdoMet possiede proprietà antiproliferative. Infatti il composto di solfonio. inibisce la risposta proliferativa in cellule di carcinoma del colon (2,3) e del fegato (1), ed è pro-apoptotica in cellule di. epatocarcinoma agendo sull'espressione di Bcl-xs (4). . . Partendo dai dati presenti in letteratura, lo scopo del nostro lavoro è quello di studiare l'effetto antiproliferativo della AdoMet su. alcune linee di carcinoma della mammella e la sua interazione farmacologica con farmaci antitumorali quali Sorafenib,. Doxorubicina e Panobinostat (LBH). . . Il sistema sperimentale utilizzato è rappresentato dalle linee cellulari MDA-MB436, MDA-MB468, MDA-MB231, CG5 e MCF-. 7. I test di vitalità cellulare sono stati condotti mediante saggi MTT dopo trattamento con i singoli farmaci o le combinazioni. farmacologiche. I dati ottenuti sono stati poi elaborati con un programma dedicato, il CalcuSyn (Chou e Talalay, Biosoft,. Oregon, USA) che partendo dai risultati sperimentali di inibizione proliferativa, ha consentito di valutare i diversi gradi di effetto. sinergico. La valutazione dell'apoptosi e dello stress ossidativo è stata effettuata mediante analisi citofluorimetrica dopo doppia. marcatura delle cellule con Annessina-V e ioduro di propidio e dopo trattamento con idroetidina, rispettivamente. La valutazione. dell'autofagia è stata effettuata con marcatura con monodandilcadaverina e valutazione citofluorimetrica della fluorescenza. associata.. . I risultati ottenuti hanno dimostrato il maggiore effetto sinergico in seguito a trattamento combinato con SAM-Doxorubicina. sulle linee cellulari CG5 e MCF-7. Tali effetti avvenivano in parallelo ad un potenziamento dell'apoptosi, stress ossidativo e. autofagia. I risultati ottenuti evidenziano l'importanza dell'effetto sinergico della SAM con la Doxorubicina nella regolazione. della proliferazione cellulare del carcinoma mammario..

INSIGHTS INTO STRUCTURAL STABILITY DETERMINANTS OF NUCLEOSIDE HYDROLASES

"Thermophilic enzymes face the challenge of maintaining optimal catalytic activity at temperatures nearing the boiling point of water, hence, they can be used as interesting model systems to understand the evolution of enzymes, as well as the molecular strategies developed as defence against thermal denaturation. Several comparisons between the structures of homologous isozymes from mesophilic and thermophilic organisms highlighted specific properties of folded proteins that may contribute to thermal stability. Moreover, the understanding of general strategies that may enhance the stability of enzymes at high temperatures could be beneficial for the engineering of biocatalysts in industrial processes. . Here we report a comparative structure-thermostability analysis of a panel of tetrameric nucleoside hydrolase (NH) enzymes from mesophiles and thermophiles by a combined structural and spectroscopic characterization that utilize principal component analysis (PCA) and differential scanning fluorimetry (DSF). . The availability of high-resolution structures of NH enzymes isolated from both mesophilic and hyperthermophilic organisms belonging to the same structural homology group, emphasizes the elements that lead to enhanced stability and underscores that resistance to thermal denaturation can be achieved using a combination of different structural solutions. Apparently, each organism can employ a different combination of stabilizing structural features to achieve the required level of NH stability. However, the multivariate analysis highlights how the NHs from mesophilic and thermophilic organisms here considered can be clustered according to the type and extent of specific features used for optimization. The results obtained indicate that the inclusion of salt bridges at the intersubunit contact surfaces is the only shared strategy in both mesophilic and thermophilic organisms to modulate the stability of NHs..