Mechanistic / mammalian target protein of rapamycin signaling in hematopoietic stem cells and leukemia

がん進展制御研究所Mechanistic/mammalian target protein of rapamycin (mTOR) is an evolutionarily conserved kinase that plays a critical role in sensing and responding to environmental determinants such as nutrient availability, energy sufficiency, stress, and growth factor concentration. mTOR participates in two complexes, designated mTOR complex 1 (mTORC1) and 2 (mTORC2), both of which phosphorylate multiple substrates. Recent studies have revealed that the fine-tuning activity of mTOR complexes contributes to both maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) and suppression of leukemogenesis. Dysregulation of mTORC1 activity results in impaired HSC homeostasis. Abnormalities of mTOR signaling are observed in many patients with leukemia and genetic studies clearly show that the leukemogenesis associated with Pten deficiency involves both mTORC1 and mTORC2. Although the several mTOR inhibitors have been developed for cancer therapy, effectiveness of the inhibitors for eradication of leukemia stem cells (LSCs) is unknown. Advances in understanding of how mTOR signaling is involved in mechanisms of normal HSC and LSC homeostasis may lead to novel therapeutic approaches that can successfully eradicate leukemia. © 2013 Japanese Cancer Association

Complete nucleotide sequence of the Cryptomeria japonica D. Don. chloroplast genome and comparative chloroplast genomics: diversified genomic structure of coniferous species

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The recent determination of complete chloroplast (cp) genomic sequences of various plant species has enabled numerous comparative analyses as well as advances in plant and genome evolutionary studies. In angiosperms, the complete cp genome sequences of about 70 species have been determined, whereas those of only three gymnosperm species, <it>Cycas taitungensis</it>, <it>Pinus thunbergii</it>, and <it>Pinus koraiensis </it>have been established. The lack of information regarding the gene content and genomic structure of gymnosperm cp genomes may severely hamper further progress of plant and cp genome evolutionary studies. To address this need, we report here the complete nucleotide sequence of the cp genome of <it>Cryptomeria japonica</it>, the first in the Cupressaceae sensu lato of gymnosperms, and provide a comparative analysis of their gene content and genomic structure that illustrates the unique genomic features of gymnosperms.</p> <p>Results</p> <p>The <it>C. japonica </it>cp genome is 131,810 bp in length, with 112 single copy genes and two duplicated (<it>trn</it>I-CAU, <it>trn</it>Q-UUG) genes that give a total of 116 genes. Compared to other land plant cp genomes, the <it>C. japonica </it>cp has lost one of the relevant large inverted repeats (IRs) found in angiosperms, fern, liverwort, and gymnosperms, such as <it>Cycas </it>and <it>Gingko</it>, and additionally has completely lost its <it>trn</it>R-CCG, partially lost its <it>trn</it>T-GGU, and shows diversification of <it>acc</it>D. The genomic structure of the <it>C. japonica </it>cp genome also differs significantly from those of other plant species. For example, we estimate that a minimum of 15 inversions would be required to transform the gene organization of the <it>Pinus thunbergii </it>cp genome into that of <it>C. japonica</it>. In the <it>C. japonica </it>cp genome, direct repeat and inverted repeat sequences are observed at the inversion and translocation endpoints, and these sequences may be associated with the genomic rearrangements.</p> <p>Conclusion</p> <p>The observed differences in genomic structure between <it>C. japonica </it>and other land plants, including pines, strongly support the theory that the large IRs stabilize the cp genome. Furthermore, the deleted large IR and the numerous genomic rearrangements that have occurred in the <it>C. japonica </it>cp genome provide new insights into both the evolutionary lineage of coniferous species in gymnosperm and the evolution of the cp genome.</p

造血幹細胞ならびに白血病幹細胞のマーキングとその動態解明

造血幹細胞および白血病幹細胞マーキングの候補としてのSide Population(SP)細胞の検討を行った。SP細胞は、造血幹細胞の集団が濃縮されていること、そのほとんどが、G0期にあり細胞分裂を起こさない状況にいること、さらに抗がん剤やG-CSFの投与によって末梢血に動員されている造血幹細胞ではそのほとんどがSPという性質を失っていること、しかしながら、SPではない造血幹細胞を移植し数ヶ月後、幹細胞が再構築した後再びSPという形質を獲得することなどが判明した。このことは、造血幹細胞の状態によってSPという形質を獲得したり、あるいは失うといった現象がおこるということを示唆している。そこで、造血幹細胞がSPという形質を獲得する要因を検討した結果、ストローマ細胞との接着がその形質の獲得に影響を与えることが判明した。一方、活性酸素が上昇した状況ではその形質を失うことから、幹細胞が骨髄のニッチにおいて存在することによって、幹細胞内の活性酸素を低下させSPという形質を獲得すると考えられた。白血病幹細胞の特定のため、白血病モデル系の樹立を試みた。造血幹細胞にレトロウイルスベクターにてがん遺伝子Meis1とHoxA9を導入し、放射線照射マウスに移植すると約50日後には骨髄性白血病が発症した。この白血病マウスの骨髄にはSP分画が存在した。しかしながら、移植実験により、これらのSPに白血病幹細胞は濃縮していないことが判明した。他の白血病モデルでの検討が必要であるが、以上の結果は、SP細胞が必ずしも白血病幹細胞のマーカーになり得ないということを意味している。文献的にヒト白血病の臨床検体を用いた検討でも、SP細胞が白血病幹細胞であるかどうか、議論の分かれるところであり、それを否定する報告もある。今回の研究結果はそれを支持するものであり、今後、別のマーカーを探索することが必要であると考えられた。We demonstrated that side population (SP), based on FACS analysis with Hoechst33342, in c-kit+Sca-1+Lin-(KSL) cells represents a population of quiescent hematopoietic stem cells (HSCs). Cell cycle analysis with BrdU labeling showed that SP were slowly cycling in GO phase. HSCs mobilized in peripheral blood from a bone marrow niche by G-CSF or 5-FU treatment were cycling and those cycling HSCs were not in SP.HSCs in developing mice, which were cycling and expanding, were also in main population (MP). SP cells in KSL fraction were resistant to myelosuppressive stress including X-ray and 5-FU treatment which depletes cycling hematopoietic cells. Histological examination revealed that the 5-FU resistant HSCs were surrounded by bone-lining osteoblast-like cells on the surface of the bone. These data indicate that the osteoblastic zone is a niche for quiescent HSCs in bone marrow. Recently tumorigenic or tumor-initiating cells, which are called cancer stem cells, have been identified. We attempted to identify cancer stem cells by using SP fraction. We established leukemia model by retroviral infection carrying HoxA9 and Meis1. The leukemia cells included SP cells in bone marrow. However transplantation experiments did not showed the evidence showing that leukemic stem cells were enriched in SP fraction. These data suggest requirement of another markers for identification of cancer stem cells.研究課題/領域番号:16590964, 研究期間(年度):2004-2005出典：「造血幹細胞ならびに白血病幹細胞のマーキングとその動態解明」研究成果報告書　課題番号16590964 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Development of Novel Treatment Strategies Targeting Cancer Stem Cells

金沢大学がん進展制御研究所本研究では、がん微小環境シグナルに支えられたがん幹細胞性獲得・維持メカニズムを理解することを目的とした。本年度は、raptor遺伝子欠損マウスを用いてmTOR複合体１の白血病幹細胞の増殖・生存における役割を解析した。その結果、白血病幹細胞維持におけるmTOR複合体1活性への依存度は、ニッチ環境の存在下と非存在下では、大きく異なることを見出した。ニッチ環境の存在しない状態でraptor遺伝子を欠損させ、mTOR複合体１の活性を失わせた状態では、その増殖や生存が著しく障害された。また、移植実験により生体内での評価を行った実験においても、比較的分化形質を示す白血病細胞では、細胞死が誘導され、mTOR複合体１への依存性が高いことが判明した。一方で、白血病幹細胞は生体内でmTOR複合体１非依存的に生存していることが明らかとなった。興味深いことに、これらの細胞は、長期的に生存するものの末梢血中での白血病の顕著な増殖は認められなかった。しかし、raptor遺伝子を導入することによって、mTOR複合体１の活性を復活させることにより、野生型と同様の白血病の発症が見られた。このことから、白血病幹細胞は、微小環境から支持され、mTOR複合体１低下に対する抵抗性を示し未分化性を保つことができると考えられた。本現象は白血病治療後の微小残存病変と類似しており、そのような病態での細胞内mTORシグナルの抑制状態と白血病幹細胞ニッチ双方の重要性が示唆された。これらの研究により、がん幹細胞の治療抵抗性メカニズムを理解する上で重要な知見を得ることができた。研究課題/領域番号:23130507, 研究期間(年度):2011-04-01 – 2013-03-3

普遍的幹細胞制御機構と腫瘍細胞分化

金沢大学がん進展制御研究所本研究では、我々が独自に開発した幹細胞分離/標識(ヌクレオステミン-GFP)システムにより、がん組織中の源となる細胞いわゆる"Tumor-initiating cell"がいかに腫瘍細胞を供給し、どのようなシグナルによって制御を受けているかを明らかにすることを目的とした。平成20年度までに作製したヌクレオステミン-GFPトランスジェニックマウス由来の脳腫瘍を作製し解析した。GFPの輝度によって細胞分画し、GFP陽性細胞が、試験管内での高い増殖能を持つこと、またこの細胞が生体内で脳腫瘍産生能をもっ細胞(Tumor-initiating cell)であることを認めた。さらにGFP陽性細胞と陰性細胞集団の遺伝子発現解析を行った。その結果、GFP陽性細胞で受容体型チロシンキナーゼc-Metの発現が有意に高いことを認めた。また、免疫組織化学法により、c-Met受容体がこれらの細胞でリン酸化していることも判明した。リガンドであるHGFの作用により、GFP陽性脳腫瘍細胞が活発にマトリゲル内に遊走することを観察した。このことから、脳腫瘍におけるTumor-initiating cellは、HGF/c-Metシグナルによって、その生存や浸潤が制御されていると考えられた。このシステムを用いることによって、脳腫瘍の未分化細胞の位置情報、特に血管構造やストローマ細胞などの微小環境からの制御機構、特に腫瘍細胞分化に関わる制御機構の解明が期待された。研究課題/領域番号:20013016, 研究期間(年度):2008 – 2009出典：研究課題「普遍的幹細胞制御機構と腫瘍細胞分化」課題番号20013016（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-20013016/）を加工して作

Multidisciplinary research on autophagy: from molecular mechanisms to disease states

金沢大学がん進展制御研究所本研究では、オートファジーが、どのように成体型造血幹細胞の成立に寄与するのか、また、関連した研究として、腫瘍幹細胞におけるオートファジーの意義を明らかにすることを目標とした。本年度は、オートファジーと深く関与するmTOR複合体1 (mTORC1)の生体内での造血幹細胞の自己複製能の役割を明らかにするため、Rheb変異マウス（Rheb f/f CreER）の骨髄細胞を放射線照射マウスに移植し、骨髄再構築が完了した後に、タモキシフェンを投与し、野生型造血細胞との競合状態を評価した。その結果、Rheb欠損による明確な造血幹細胞異常は認められないことが判明した。さらに、マウスに低線量のX線を照射しても、その結果には影響をしていなかった。したがって、定常状態および傷害ストレス下においてもRheb依存的な幹細胞の異常は認められなかった。一方、Raptor欠損に関しては顕著な造血幹細胞の現象が認められることから、mTORC１自体は造血幹細胞の自己複製に必須であるが、PI3K-AKT以外の上流の重要性が示唆された。また、オートファジーの活性化による造血幹細胞保護作用の可能性が示された。以上のように、本研究成果は、オートファジーの役割を明確にするための意義ある情報となった。また、脳腫瘍幹細胞において、ATG5遺伝子を破壊し、未分化性に関する指標を解析した結果、オートファジー不全状態は、通常状態では何ら影響を及ぼさないものの、ミトコンドリア傷害性の抗がん剤に対する感受性の亢進に寄与することが判明した。本成果により、将来、臨床的に有用な治療法の開発に寄与する可能性が示唆された。研究課題/領域番号:15H01509, 研究期間(年度):2015-04-01 – 2017-03-3

Establishing a new paradigm of the pathogenesis of diseases through the understanding of stem cell aging

金沢大学がん進展制御研究所本研究では，高脂肪食という栄養的ストレス下において，造血幹細胞の恒常性を保つための機構を理解することを目的とした。本年度は、昨年に引き続き、Spred1の高脂肪食における役割を解析した。高脂肪食による過栄養状態では，Spred1欠損造血幹細胞の機能障害が生じることが観察されたため、そのメカニズムの解明を目指し、腸内細菌叢との関連を検討した。まず、野生型マウスとSpred1欠損マウスの両者を普通食および高脂肪食群、計4群に分け、それぞれのマウスから糞便を採取し、16S rRNAを次世代シークエンサーにて解析し、細菌叢の変化を観察した。予想通り、高脂肪食群では、グラム陰性菌の増加が観察された。Spred1欠損の有無によって、腸内細菌叢の違いは顕著には認められなかった。ただし、詳細に観察することで、Spred1特有の細菌叢が存在する可能性も示されたため、今後の検討が必要である。腸内細菌叢を除去する目的で、抗生剤カクテルを投与したところ、血液異常は部分的に回復した。また、造血幹細胞の機能低下も有意に回復した。以上の結果より、Spred1欠損マウスでは、腸内細菌叢の異常が造血幹細胞に作用し、造血異常を引き起こしていると考えられた。また、Spred1は、異常な食餌（高脂肪食）による環境変化に対して、造血幹細胞を保護する役割を有することが明らかとなった。本シグナルの詳細な解析と人為的に変化させる技術開発を進めることによって、幹細胞老化の本態を理解し、アンチエイジングなどの革新的医療技術の開発に寄与できると考えられた。研究課題/領域番号:17H05638, 研究期間(年度):2017-04-01 – 2019-03-3

腫瘍悪性度進展における未分化性獲得メカニズムの解明

金沢大学がん研究所本研究は、腫瘍発生、悪性化メカニズムを幹細胞の分化や未分化性維持機構との関連を中心に解き明かそうというコンセプトに基づいた萌芽的研究である。具体的には、悪性脳腫瘍であるグリオーマをモデルとして、悪性度の進展における未分化性獲得メカニズムの解明に取り組んだ。グリオーマgrade IIIとgrade IVの違いを詳細に比較検討することによって、腫瘍発生・悪性度進展メカニズムの解明を目的に、神経幹細胞におけるEGF-RAS経路活性化状態における細胞分化運命決定に対する影響を解析した。その結果、RAS活性化が神経幹細胞のグリア系への分化を誘導すること、この分化誘導が阻害されると腫瘍形成が促進されることを見い出した。さらに、本モデルを遺伝子改変マウスと組み合わせることによって、ヒトのグリーマgrade IIIあるいはgrade IVと同じ病理的特徴を持つ腫瘍を再現させることに成功した。悪性度の高い腫瘍(GBM,grade IV)ほど、未分化抗原の発現が見られ、一方悪性度の低い腫瘍(Anaplastic astrocytoma,grade III)では、分化抗原が高い発現を示していた。grade IVはsphere形成能を示すが、grade IIIではその活性が見られないなど、悪性度と未分化性の相関を確認した。この研究成果は、脳腫瘍悪性進展に関わる因子の同定に寄与すると考えられ、予後因子の特定を含む診断技術の向上、新規治療法の開発を目指す礎となる。研究課題/領域番号:22650226, 研究期間(年度):2010出典：研究課題「腫瘍悪性度進展における未分化性獲得メカニズムの解明」課題番号22650226（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-22650226/）を加工して作

幹細胞自己複製と寿命・老化制御における分子基盤の共通性

金沢大学がん進展制御研究所本年度は、加齢による幹細胞機能の変化を幹細胞の老化の観点から検討した。マウスの造血幹細胞機能は、加齢マウスにおいても低下しないことが示されている。そこで、造血幹細胞の老化を、連続骨髄移植を行うことによって観察した。この連続移植の過程で活性酸素が上昇することが判明した。この活性酸素の上昇と幹細胞機能の低下に相関を見出した。連続移植後の造血幹細胞の老化を検討したところ、p16INK4a,p19ARFといった老化のバイオマーカーは上昇していた。同様に活性酸素が上昇しているATM欠損マウスの造血幹細胞においてもこれらのマーカーは上昇していたもののSA-b-galのような一般的な老化の指標は検出されなかった。このことは、いわゆる細胞老化が造血幹細胞で起こっていないことを意味するのか、あるいは検出の指標が適切ではないのか検討することの必要性が判明した。一方、線虫で寿命していることが知られているDaf-16の哺乳動物相同遺伝子FOXO3aの欠損血液細胞においても幹細胞プールが維持できないことが判明した。この変異造血幹細胞において、活性酸素の上昇およびp38MAPK活性化が観察された。興味深いことに、このp38MAPKの活性化は幹細胞特異的に観察され、活性酸素に対する反応は、幹細胞レベルと分化細胞レベルでは明らかな相違があることが示唆された。しかしながら、p16INK4aの上昇は見られなかったため、これらの幹細胞プールの枯渇現象と細胞老化の関係についてさらに検討の必要があることが明らかとなった。研究課題/領域番号:17045029, 研究期間(年度):2005 – 2006出典：「幹細胞自己複製と寿命・老化制御における分子基盤の共通性」研究成果報告書　課題番号17045029（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17045029/)を加工して作