Caracterizacion de la expresion de genes sin funcion conocida como respuesta al estres gravitatorio en Pinus radiata

72 p.El presente estudio busca caracterizar la expresión de genes sin función conocida como respuesta al estrés gravitatorio en Pinus radiata, para lo cual se evaluó el comportamiento de 69 plantas sometidas a inclinación de 45°, comparándose con 25 plantas controles de crecimiento normal. Se colectaron muestras de tallo superior, tallo inferior, hoja y raíz durante diferentes tiempos para evaluar tanto la respuesta inmediata como la respuesta tardía. Las muestras fueron transportadas y almacenadas a -80°C hasta el momento de su procesamiento. Se extrajo RNA total de los tejidos por método de CTAB. En una primera instancia se trabajó con RNA de tallo el cual fue transformado a cDNA para identificar los fragmentos expresados diferencialmente en tallos tratados versus los controles mediante Hibridación Sustractiva. Se lograron secuenciar 31 fragmentos de los cuales 12 no presentaban homología con alguna proteína identificada anteriormente. Se procedió a estudiar su expresión en los diferentes tejidos de la planta y a diferentes tiempos por método de hibridación. Los resultados obtenidos por Northern muestran que no existió hibridación con los clones N° 1, 3, 12, 29, 30 y 31, mientras que si hubo hibridación de una secuencia control constitutiva de 18S, validando la técnica. Variadas hipótesis se analizan como posibles responsables de este resultado, cobrando mayor relevancia la que sugiere que la técnica no es tan sensible como las muestras lo requieren dado que únicamente algunas capas del xilema pueden responder a los estímulos realizados

Estudio de la modificacion genica en conifera como respuesta a la perdida de verticalidad

75 p.En el presente trabajo se estudió la expresión diferencial de genes de xilema de plántulas de Pinus radiata expuestas a una inclinación de 45°. Al extraer el RNA y analizar los ranscritos, se busca determinar el mecanismo molecular implicado en la respuesta a la pérdida de verticalidad de fuste durante el crecimiento. Se evaluó el comportamiento de 69 plantas sometidas al tratamiento, comparándose contra 25 plantas controles con crecimiento normal. Se colectaron muestras a partir de tallo superior, tallo inferior, hoja y raíz, durante tres tiempos diferentes (2:30 horas, 10 horas y 24 horas), se transportaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta su posterior procesamiento. Se extrajo el RNA por el método de CTAB, posteriormente se sometió a tratamiento con DNAsa para sintetizar a partir del RNA cDNA, el cual se procesó por SSH para generar bibliotecas de ESTs. La clonación y la caracterización de los genes expresados se realizó mediante Hibridación Sustractiva. Se secuenciaron 31 fragmentos diferenciales dentro de los cuales se identificaron genes estructurales de pared celular, trasporte, metabolismo y otros. Así mismo se realizó una hibridación de RNA total en membrana con los distintos fragmentos secuenciados por SSH, observándose solamente una hibridación positiva con el clon 8, el cual representa el gen que codifica a la enzima adenosil metionina sintetasa relacionada con el proceso de biosíntesis de las poliaminas e involucradas en la multiplicación y en el crecimiento celular en el pino, observándose una expresión no tejido específica de esta secuencia. Las demás hibridaciones no entregaron resultados positivos por lo cual se seguirá el estudio, con el uso de técnicas más sensibles como PCR en tiempo real

Estudios y caracterizacion de genes expresados diferencialmente en Fragaria chiloensis en respuesta a infeccion por Botrytis cinerea

88 p.Esta memoria trata sobre el análisis de dos secuencias de genes de Fragaria chiloensis obtenidas por hibridación substractiva, generada a partir de plantas sometidas a infección con Botrytis cinerea. Estas secuencias presentan clara homología con genes AAT de Fragaria x ananassa luego de realizar un estudio de BLAST. A partir de las secuencias obtenidas, se diseñaron partidores específicos para así realizar, en un trabajo posterior, un RACE (Rapad Amplification of cDNA Ends) y así extender el largo de los fragmentos. Para poder obtener partidores específicos para ambas secuencias, se realizó una comparación con otras secuencias AAT de F. chiloensis, previa limpieza de éstas por análisis de cromatogramas. Las secuencias AAT fueron traducidas y comparadas con secuencias AAT aminoacidicas de frutos climatéricos y no climatéricos. Se vio que la identidad es alta aún cuando se comparan AATs entre diferentes especies y además que existen dominios idénticos entre AATs de frutos climatéricos y no climatéricos. Además, se prepararon todas las muestras necesarias para la continuación del estudio, es decir, se realizó extracción de material genético (RNA) de F. chiloensis y F. ananassa, con la consecuente síntesis de cDNA a concentración fija

Aislamiento y caracterizacion del gen xet de Fragaria chiloensis

57 p.Debido a sus peculiares características como color, sabor y aroma, la frutilla nativa chilena (Fragaria chiloensis) promete ser un importante producto agrícola para nuestro país. Desde el punto de vista de su comercialización y conservación, la firmeza del fruto es una propiedad determinante. Actualmente gran parte de lo que corresponde al proceso de ablandamiento ya ha sido esclarecido, sin embargo, todavía no existe un conocimiento cabal de los genes que intervienen en la perdida de firmeza de la fruta. Se sabe que el ablandamiento de los frutos es un proceso que ocurre a medida que estos maduran y son atribuibles a modificaciones en la composición y estructura de los diversos componentes de la pared celular, tales como celulosa, hemicelulosas y pectinas, las cuales son afectadas por una serie de enzimas que desencadenan un relajamiento de la pared por medio de la solubilización y despolimerización de sus componentes. En el caso específico de la frutilla nativa blanca, estudios previos han mostrado que en los frutos se aprecia un fuerte descenso en la firmeza durante el proceso de maduración, específicamente cuando pasan del estadio verde (II) al blanco (III). Debido a esto, el objetivo principal de este proyecto es determinar la importancia que puede tener el gen que codifica para la enzima Xiloglucano Endotransglicosilasa (XET), como factor importante en la degradación de pared celular y por tanto en la pérdida de la firmeza del fruto de Fragaria chiloensis. Para esto se procedió a extraer RNA desde los distintos estadios de maduración del fruto y comparar su expresión utilizando como metodología la Reacción de Polimerasa en Cadena Semicuantitiva (SQ-PCR)

Tipificacion molecular del fenotipo racimo largo de Cabernet...

29 p.En Chile, el cultivar Cabernet Sauvignon presenta una variante del fenotipo tradicional de planta, la que se diferencia únicamente en el tamaño de sus racimos, haciendo difícil su identificación y separación a la hora del establecimiento de un viñedo. La forma variante produce un tipo de racimo más grande y pesado que el tradicional, confiriéndole un mayor potencial en su productividad. Se evaluaron dos poblaciones, una perteneciente al vivero del INIA Cauquenes (conservación de material variante) y otra localizada en Villa Prat (viñedo comercial). Se estableció un patrón molecular, a través del uso de 40 diferentes marcadores moleculares. Paralelamente, se estableció un patrón ampelográfico de las plantas en estudio, a través del análisis de diversos caracteres morfológicos. El uso de una secuencia “anchored primer” específicamente el #811, arrojó dos bandas diferenciadoras entre ambos tipos de racimos, una de 800 pb que se presentaba en individuos de racimos cortos y no se presentaba en individuos de racimos largos, esto independiente de la localidad de origen de las muestras. Además de una banda cercana a los 340 pb que estaba presente en los individuos de racimo largo y no en los racimos cortos. Por otra parte, el uso de dos combinaciones de retrotransposones, PBScop/U5inv y R1/R2, entregaron diferencias polimórficas entre los individuos de Villa Prat y de Cauquenes, tanto de racimo corto como de racimo largo. Estas diferencias polimórficas fueron visualizadas en geles de agarosa y en geles de poliacrilamida. Posteriormente, las bandas generadas por estos marcadores moleculares fueron utilizadas para la confección de un fenograma representativo de los cultivares estudiados, utilizando el paquete estadístico computacional NTsys versión 2.1. Además se realizó un AMOVA el cual indicó la existencia de diferencias altamente significativas entre las poblaciones de racimos cortos y racimos largos. El estudio ampelográfico apuntó a la existencia de diferencias morfológicas altamente significativas, existentes solo en el largo del racimo, entre ambas poblaciones, esto fue evaluado a través de la prueba estadística de Kruskal Wallis

Estudio Proteomico de la formacion de madera en Pino Maritimo, Pinus pinaster

168 p.Las propiedades de la madera en pino marítimo varían tanto a nivel químico, anatómico y mecánico. Seis tipos de madera se pueden encontrar al seno de un mismo árbol: madera temprana, madera tardía, madera de copa, madera de base, madera de compresión y madera opuesta. En este trabajo de tesis, hemos testeado la hipótesis según la cual la variabilidad fenotípica de las propiedades de la madera, están liadas a la expresión diferencial de proteínas a través de la xilogénesis. Por una aproximación proteómica, basada en la electroforesis bidimensional y la espectrometría de masas en tándem (LC ESI MS/MS), hemos identificado 165 proteínas diferencialmente exprimidas a lo largo de un gradiente de edad cambial ( madera juvenil y madera madura) y 93 proteínas diferencialmente exprimidas en el curso de una temporada de crecimiento (madera de primavera y madera de verano) en pino marítimo . Un análisis químico complementario se realizo a las muestras por pirolisis analítica. Nuestros resultados mostraron que el xilema secundario formado al inicio de la temporada así Como el formado por un cambium joven presentan una sobre expresión de proteínas que participan en la división celular. En el xilema formado a partir de un cambium maduro o al fin de la temporada hemos descubierto proteínas implicadas en la defensa celular ( su rol seria evitar la muerte celular programada), y proteínas implicadas en la biosíntesis de elementos constitutivos de la pared. Este estudio contribuye a reforzar nuestros conocimientos sobre las actividades moleculares que intervienen durante la xilogénesis. Se descubren por otro lado, pistas de investigación a seguir sobre la detección de genes implicados en el control genético de las propiedades de la madera en un objetivo de selección asistida por marcadore

Caracterizacion estructural de la proteina alcohol acil transferasa asociada a la biosintesis de compuestos volatiles en Vasconcellea pubescens

89 p.El aroma de los frutos es un importante atributo de calidad que influye en la aceptación del consumidor, es un carácter complejo, determinado por un conjunto de compuestos volátiles de bajo peso molecular. En Vasconcellea pubescens (papaya cultivada en Chile) el aroma del frutos es atribuido principalmente a ésteres de bajo peso molecular, los cuales son producidos mediante reacciones de esterificación entre alcoholes y acil CoAs catalizadas por la enzima Alcohol Acil Transferasa (VpAAT1). Con el objeto de aumentar nuestro entendimiento acerca de la producción de aroma durante el proceso de maduración del fruto V. pubescens, se realizó un estudio de los mecanismos moleculares de la VpAAT1, mediante la técnica de modelamiento comparativo, construyendo la estructura tridimensional de la enzima la cual fue validada y refinada mediante dinámica molecular. El modelo resultante mostró que la proteína está formada por 15 hojas β, 11 α hélices y 4 hélices denominadas Hélices 310. El sitio activo de la proteína es el segmento HTMSD y se encuentra en un loop entre la hoja β 7 y la α hélice 5. La dinámica molecular de 2ns mostró que la H166 y D170 forman parte del sito activo, orientando sus cadenas laterales hacia un canal de solvente presente en el centro de la enzima, permitiendo una interacción directa entre estos residuos con acil-CoA y alcohol. Por docking molecular se exploraron las diversas posibilidades de interacción entre la proteína y sus dos ligandos. Para la interacción con alcoholes y acil CoAs se sugiere la conformación más estable del complejo formado por estas tres moléculas de forma de reproducir el posible mecanismo catalítico de la enzima. Al mutar la H166 por Alanina, se determinó la importancia del residuo de Histidina dentro de la actividad catalítica de la enzima, lo cual reflejó diferencias importantes en los valores energéticos de la enzima silvestre versus la mutante, siendo más estable la proteína silvestre. De esta manera, el modelo sugiere el mecanismo de acción de la enzima VpAA

Aislamiento e identificacion de secuencias parciales de genes implicados en la bionsintesis de antocianinas en F. chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis

52 P.Las antocianinas son sintetizadas desde un brazo metabólico de los flavonoides. Las enzimas participantes en tales procesos utilizan los productos generados desde la ruta metabólica fenilpropanoide (p-coumaroil CoA) y las generadas en el metabolismo de ácidos grasos (malonil CoA). La biosíntesis de antocianinas se inicia con la reacción catalizada por la enzima chalcona sintasa y consecutivamente participan las enzimas: chalcona isomerasa, flavanona 3-hidroxilasa, dihidroflavonol 4-reductasa y antocianidina sintasa. En la presente memoria se analizaron las secuencias nucleotídicas parciales que codifican para la síntesis de táles enzimas. Para ello se extrajo muestras de RNA de la especie F. chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis, que se caracteriza por presentar bajos niveles de antocianinas. El RNA obtenido fue utilizado para la generación de cDNA, necesario para las reacciones de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) realizadas, cuyos productos de amplificación obtenidos, mediante la utilización de partidores específicos, fueron utilizados para la transformación de células competentes, necesarias para obtener una alta cantidad de clones de los productos de amplificación generados. Consiguientemente se realizó una PCR de colonias y sus productos de amplificación fueron secuenciados en Macrogen Inc., Korea. Una vez recibidas las secuencias fueron depuradas y transformadas a secuencias aminoacídicas para su siguiente análisis. Este último consistió en compararlas, mediante alineamientos múltiples, con la estructura primaria de las mismas enzimas, pero pertenecientes a otras especies. Los resultados evidenciaron la existencia de dominios conservados en varias especies de la misma familia a la cual pertenece la especie en estudio. Pero estos dominios desaparecen, en cierta medida, cuando los alineamientos se hacen con especies de diferente familia. Por otra parte, las secuencias obtenidas contienen aminoácidos altamente conservados e importantes desde el punto de vista funcional de las enzimas en estudio. Por lo tanto se puede establecer que, las secuencias parciales de los genes analizados contienen factores que son constantes en las especies analizadas e importantes para el desarrollo de una función enzimática apropiada para la vía biosintética en estudio

Análisis de la expresión diferencial de genes involucrados en las vías metabólicas responsables de la síntesis de antocianinas en frutos de Fragaria chilensis ssp. chiloensis f. chiloensis y Fragaria chiloensis ssp. chilensis f. patagónica

133 p.El objetivo de la tesis doctoral fue realizar un estudio comparativo de la pigmentación de fruto dentro de las dos formas botánicas de Fragaria chiloensis ssp. chiloensis. El estudio fue abordado a nivel transcripcional y químico. Para ello, frutos de ambas formas botánicas, f. chiloensis (frutilla nativa blanca) y f. patagonica (frutilla nativa roja), fueron recolectados en cuatro distintos estadios de desarrollo y maduración (verde pequeño, verde grande, blanco y maduro). A partir de fruto completo, sus órganos constituyentes (receptáculo y aquenio) y tejidos, se analizaron los perfiles transcripcionales de genes estructurales y regulatorios (factores de transcripción) involucrados en las vías de biosíntesis de compuestos fenilpropanoides responsables de la formación de antocianinas a lo largo de los diferentes estadios. Mediante este exhaustivo análisis transcripcional, se seleccionó uno de los genes regulatorios, FcMYB1, debido a su expresión diferencial detectada entre receptáculo de fruto rojo y blanco. El ortólogo de este gen aislado en frutilla comercial demostró ser un supresor de la acumulación de pigmentos antociánicos en el sistema heterólogo de Nicotiana. Para caracterizar su función de manera homóloga en Fragaria chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis, frutos de frutilla blanca en estadio verde grande fueron agroinyectados con una cepa de A. tumefaciens portadora de una construcción de RNAi para FcMYB1 y cosechados en estadio maduro. Este trabajo demostró que la supresión génica del factor de transcripción FcMYB1 propició la aparición de un fenotipo de frutos más pigmentados que los frutos control agroinyectados con vector vacío. Consecuentemente, los genes flavonoides finales relacionados con la biosíntesis de proantocianidinas mostraron niveles muy bajos de transcritos de leucoantocianidina reductasa (LAR) y antocianidina reductasa (ANR) en contraste con los niveles aumentados de transcritos de genes directamente relacionados con la biosíntesis de pigmentos antociánicos, antocianidina sintasa (ANS) y UDP-glicosiltransfersa (UFGT). Esta redirección a nivel transcripcional de la vía flavonoides coincidió con una mayor acumulación de antocianinas en frutos agroinyectados con la construcción RNAi-FcMYB1 detectadas por HPLC-DAD. En conclusión, por medio del estudio comparativo en frutos contrastantes en pigmentación de una misma especie de frutilla, se detectaron diferencias en los niveles de transcritos de genes estructurales y regulatorios. Tras este análisis se seleccionó un factor de transcripción que demostró ser importante en la producción de pigmentos en esta especie. Los genes diferencialmente expresados (estructurales y/o regulatorios) identificados en esta investigación pueden ser empleados como marcadores moleculares para asistir los programas de mejoramiento genético de frutilla./ABSTRACT: The aim of this doctoral thesis was to perform a comparative study of the fruit pigmentation of two botanical forms of Fragaria chiloensis ssp. chiloensis. The study was carried out at the transcriptional and chemical level. For this purpose, fruits of both botanical forms, f. chiloensis (white native strawberry) and f. patagonica (red native strawberry), were collected and sorted in four distinct developmental and ripening stages (small green, large green, white and ripe). From whole fruit, their constituent organs (receptacle and achene) and tissues, the transcriptional profiles of structural and regulatory (transcription factors) genes involved in anthocyanin related biosynthesis pathways were assessed among the different stages. By means of this exhaustive transcriptional analysis, FcMYB1, a regulatoty gene was selected due to its differential expression detected between the receptacle of red and white fruits. Its orthologous gene isolated from the commercial strawberry demonstrated it to be a suppressor of the anthocyanin pigment as shown by accumulation in the heterologous system Nicotiana. For characterizing its function in a homologue manner in Fragaria chiloensis ssp. chiloensis f. chiloensis, fruits of white strawberry at large green stage were agroinjected with an A. tumefaciens strain bearing a RNAi construct for FcMYB1 and collected at ripe stage. According to this work, the gene suppression of this FT FcMYB1 favored a more pigmented phenotype in these fruits than in control fruits agroinjected with empty vector. Consequently, the final flavonoid genes related with proanthocyanidin biosynthesis showed very low levels of leucoanthocyanidin reductase (LAR) and anthocyanidin reductase (ANR) in contrast to the elevated transcript levels of genes closely related to anthocyanic pigment biosynthesis, anthocyanidin synthase (ANS) y UDP-glycosyltransferse (UFGT). This flavonoid pathway redirection at the transcriptional level coincided with a greater accumulation of anthocyanin in RNAi-FcMYB1 agroinjected fruits assessed by HPLC-DAD. In conclusion, through this comparative study carried out in fruits with contrasting pigmentation in the same strawberry species, differences in transcript levels of structural and regulatory genes were detected. After this analysis, a transcription factor that proved to be important in the pigment production in this specie was selected. Differentially expressed (structural and/or regulatory) genes identified in this research could be used as molecular markers for assisting strawberry breeding programs

Identificacion de genes expresados en Fragaria chiloensis en respuesta a Botrytis cinerea

154 p.Uno de los problemas más importantes de la post-cosecha en frutilla comercialmente cultivada, lo constituye la enfermedad pudrición gris, causada por el hongo Botrytis cinerea Pers. la que se encuentra ampliamente distribuida en más de 200 especies de importancia económica. Desde hace tiempo a Fragaria chiloensis, se le ha conocido por poseer una alta tolerancia a un gran espectro de enfermedades, incluyendo Botritis. Considerando lo anterior, se desarrolló un estudio de diversidad génica en esta especie que consistió en analizar individuos de Fragaria chiloensis provenientes de las zonas de Contulmo (región del Bio Bio), Chillán (región del Bio Bio) y Vilches (región del Maule) y compararlas con la especie comercial Fragaria x ananassa cv. Chandler, usando para ello, partidores ISSRs (inter simple secuense repeat). De las formas estudiadas de Fragaria chiloensis (Contulmo; Chillán y Vilches) la que presentó una mayor similitud fue la accesión de Contulmo (88 al 100%), seguido de Vilches y Chillán (70 al 100%). Para el caso de las muestras de Fragaria x ananassa, el grado de similitud varió desde los 50 a 100%. La diversidad genética fue representada por el coeficiente PhiPT (0,54337), el cual explica una diferenciación completa entre poblaciones. Paralelamente se realizaron ensayos de infección con Botrytis cinerea, observando que los poblaciones de Fragaria chiloensis provenientes de Chillán y Vilches al igual que Fragaria x ananassa cv. Chandler presentaron las primeras lesiones necróticas tres días post-inoculación con un 2 a 4% de cubrimiento del área foliar. Por el contrario, la accesión proveniente de Contulmo presentó las primeras lesiones al quinto día post-inoculación con un 3% de cubrimiento, siendo este más homogéneo genéticamente y mostrando una mayor tolerancia a Botrytis cinerea. En base a esto, se realizó una clasificación individual de las plantas del grupo Contulmo en donde se analizó a los 13 días post-inoculación la respuesta de F. chiloensis a la infección por B. cinerea. Se encontraron diferencias significativas (p≤ 0.01) en cuanto a respuesta, diferenciándose cinco categorías, las cuales se denominaron:altamente resistentes (AR), resistentes (R), tolerantes (T), moderadamente tolerante (MT) y susceptible (S), destacándose que la mayor parte del grupo presentó la respuesta de tolerancia (50%), seguido de la respuesta moderadamente tolerante (25%). Lo anterior, se confirma que F. chiloensis (Contulmo) posee una capacidad de tolerar la infección por parte del patógeno en estudio. A partir de estos resultados en una segunda parte se estudió los genes involucrados en la respuesta patogénica y que son expresados en F. chiloensis. Para ello, a través de la técnica HSS (hibridación subtractiva por supresión) se identificaron tanto secuencias asociadas previamente a respuesta a patógenos, como también algunas de función desconocida, o que podrían alterar la expresión de la planta en respuesta a B. cinerea. Del grupo de transcritos descritos, se encontraron dos proteínas relacionadas a patogénesis tales como, Thaumathin –like protein (FcPR5) y Mal d 1 (FcPR10). FcPR10 se expresó tanto en hojas como en frutos de Fragaria chiloensis, pero el más alto número de transcritos, se observó en los últimos. Por otra parte, FcPR5 se expresó en frutos y hojas de Fragaria chiloensis, encontrándose una mayor inducción en el número de transcritos en hojas./ ABSTRACT: One of the most important post-harvest problems in the commercial strawberry is gray mold, caused by the fungus Botrytis cinerea Pers. This pathogen has a wide host range, affecting more than 200 cultivated species. For a long time it has been known that Fragaria chiloensis has higher tolerance against to number of diseases, including Botritis. According to this a genetic diversity study was performed in this species, analyzing individuals from three different Fragaria chiloensis zone (Contulmo, Chillán and Vilches). These were compared to Fragaria x ananassa cv. Chandler using anchored primers or ISSR (inter simple sequence repeat). Among them, Contulmo presented the higher similarity (88 to 100 %) followed by Chillán and Vilches (70 to 100%). In Fragaria x ananassa the degree similarity of was between 50 and 100%. The genetic diversity was represented by the PhiPT coefficient (0.54337) which complete explains differentiation between populations. At the same time infection assays were developed, where the Fragaria x ananassa and Fragaria chiloensis plants from Chillán and Vilches developed the first necrotic lesions three days after inoculation, covering 2 to 4% of the leaf area. On the other hand in the Fragaria chiloensis group from Contulmo, the first necrotic lesions appeared five days after inoculation, covering 3% of the leaf area. This group was genetically more homogeneous and tolerant to gray mold. According to this response, the plants of this group were classified in five categories: highly resistant, resistant, tolerant, moderately tolerant and susceptible. Most of the individuals were categorized in the third (50%) and fourth (25%) group. In the second part of this study some of the genes related to the response to the pathogen in Chilean strawberry were studied. Using the Suppressive Subtractive Hybridizing technique, different sequences were identified, not only associated to pathogen response but also to plant expression changes. Two of them were studied in detail, which presented a high homology to Thaumathin –like protein (FcPR5) and Mal d 1 (FcPR10). FcPR10 was expressed in leaves and fruit of Fragaria chiloensis, but the higher number of transcripts was determined fruits. On the other hand FcPR5 was expressed in fruit and leaves of Fragaria chiloensis, but in the leaves the transcript induction was highest