Detection and Removal of Surface-Bound Pyrogenic Contaminations

Abstract is not availableJRC.I.4-Nanotechnology and Molecular Imagin

Nachweis und Entfernung von oberflächengebundenen, pyrogenen Verunreinigungen

Medizinprodukte, wie z.B. Kontaktlinsen, Endoskope oder Implantate, finden weltweit ständig wachsende Anwendung. Auch wenn sie jedes Jahr Millionen von Menschenleben retten, können doch zahlreiche Schwierigkeiten auftreten. Beginnend z.B. mit einer Blaseninfektion während eines Krankenhausaufenthaltes bis hin zu Implantatabstoßung und Gewebezerstörung ist eine ganze Palette von Komplikationen möglich. Manche dieser Problematiken werden von fieber-induzierenden Substanzen (Pyrogenen) ausgelöst, die erstens nicht von den angewandten Pyrogentests erkannt werden und zweitens durch Routinesterilisation nicht ausreichend entfernt werden. Um dieser Problematik entgegenzutreten, wurden zwei neue Verfahren miteinander kombiniert und optimiert. Die Anwendung des humanen Vollblutmodells, welches die humane Fieberreaktion in vitro (im Reagenzglas) nutzt, als ein sensitives Nachweissystem, das die inflammatorische Kapazität von Oberflächen wiederspiegelt, und das Niederdruck-Mikrowellen-Entladungsplasma als eine effiziente ungefährliche Sterilisationsmethode, wurden miteinander kombiniert.Es ist uns gelungen, einen Metallblock zu entwickeln, in den verschiedene Materialien als Platten eingelegt werden können, um die humane Vollblutinkubation mit anschließender Zytokinbestimmung (Interleukin-1-beta), inklusive Positiv- und Negativkontrollen, direkt auf der Oberfläche desselben Prüfkörpers durchzuführen.Der in vitro Pyrogentest für Oberflächen war in der Lage, auf verschiedenen Materialien getrocknete Pyrogenverunreinigungen mit einer Sensitivität von 10 pg/ml im Falle von Lipopolysaccharid (LPS) zu erkennen. Die Verwendung von gefrierkonserviertem Blut wurde untersucht und erzielte sogar eine niedrigere Nachweisgrenze.Verschiede immun-stimulierende Substanzen wie Lipid A, der LPS-Anker, Lipoteichonsäure (LTA) von zwei verschieden Bakterienstämmen und in zwei verschiedenen Arten präpariert, Peptidoglykan (PGN) von drei verschiedenen Bakterienstämmen (zwei Gram-positive und ein Gram-negativer), Zymosan und Kombinationen von ihnen wurden eingesetzt und alle konnten konzentrationsabhängig nachgewiesen werden.Auch manuelle Verunreinigungen, die wahrscheinlichste Situation im Herstellungsprozess eines Medizinprodukts, wurden untersucht und erzielten hohe Zytokinsignale. Verschiedene Reinigungs- und Sterilisationsmethoden wie Waschen, Bürsten, Autoklavieren und trockene Hitze wurden eingesetzt, aber keine ausreichende Verringerung der gemessenen Bioaktivität wurde festgestellt.Die Verwendung des Niederdruck-Mikrowellen-Entladungs-Plasmas ist eine neue Sterilisationsmethode, die eine Abnahme der Bioaktivität von LPS um zwei Zehnerpotenzen erzielt. Auf der Suche nach dem ausschlaggebenden Depyrogenisierungsreagenz und möglichen Nebeneffekten konnten folgende Ergebnisse geschlussfolgert werden: Die beobachtete Abnahme wird verursacht durch ein Plasma-Pyrogen-Zusammenspiel. Erhöhte Temperatur, Mikrowellenstrahlung und Niederdruckbedingungen spielen dabei keine Schlüsselrolle. Weder ultraviolette Strahlung noch geladene Teilchen beeinflussen die Bioaktivitätsabnahme. Unter unseren experimentellen Bedingungen ist das Vorhandensein von atomarem Wasserstoff das depyrogenisierende Wirkprinzip. Der LPS-Inaktivierungsverlauf ist eine nicht-lineare Funktion der Zeit mit mindestens zwei Phasen, die in ihrer Beseitigungseffizienz signifikant unterschiedlich sind.Zusammenfassung der Vorteile der zwei kombinierten Systeme:Der Pyrogentest für Oberflächenist quantitativ, sensitiv und bietet umfangreiche Anwendungsmöglichkeitenist einfach, robust und praktischbasiert auf der humanen FieberreaktionDie Nachweisbarkeit eines breiten Pyrogenspektrums ist garantiertKeine Tierversuche sind beteiligtDas Niederdruck-Mikrowellen-Plasmaarbeitet schnell und effizientNiedrige Temperatur wird verwendetPreiswertOhne giftige ZusätzeKeine Sicherheitsrisiken für Personal oder UmweltDas neue Testsystem erlaubt eine immunologische Qualitätskontrolle durch einen einfachen, standardisierten Test während des Herstellungsprozesses und vor der Implantierung, um eine Pyrogenkontamination auszuschließen. Eine adäquate Möglichkeit wird damit geboten, um zu kontrollieren, ob verschiedene Materialien immunologisch inaktiv, ausreichend depyrogenisiert oder gesäubert sind.Wir stellten fest, daß das Niederdruck-Mikrowellen-Entladungsplasma eine geeignete Methode ist, um immunaktivierende Verunreinigungen sehr schnell und effizient unter preiswerten und Niedrigtemperatur-Bedingungen, ohne mit dem zugrundeliegenden Substrat zu interagieren und ohne Verwendung von giftigen Zusätze zu entfernen.Daher ist die Basis für eine neue Dimension des Verbraucherschutzes gelegt, auch wenn die schlussendlichen Bedingungen für manche Verbindungen noch optimiert werden müssen

Plasma Based De-Pyrogenization

Applicability of low pressure microwave discharges for the de-pyrogenization of heat sensitive materials has been tested. It has been found that discharges in selected gas mixtures are capable to reduce significantly the amount of deposited pyrogens within 1 minute of plasma treatment. Moreover it has been demonstrated that de-pyrogenization is due to the plasma interactions with pyrogens and cannot be ascribed to the action of possible side effects.JRC.I.4-Nanotechnology and Molecular Imagin

Decontamination of Surfaces by Low Pressure Plasma Discharges

Non-equilibrium discharges in molecular gases and their mixtures have been extensively studied due to their applicability in different areas of surface treatment, cleaning and functionalization. In this paper, the feasibility of the use of low pressure discharges for sterilization and decontamination, i.e., a topic that has attracted great attention recently, is demonstrated and discussed using examples of bacterial spore sterilization and depyrogenation of bacterial endotoxins, as well as the elimination of protein films.JRC.I.4-Nanotechnology and Molecular Imagin

Effect of the Low-Pressure Microwave Discharges on the Pyrogens Bioactivity

The effect of microwave discharge on the pyrogens bioactivity has been studied in different oxygen and hydrogen containing mixtures with the aim of identifying the crucial de-pyrogenization agent. According to the obtained biological results and their comparison with properties of the plasma determined by means of the optical emission spectroscopy and Langmuir probe measurements, it has been found that under experimental conditions tested the de-pyrogenization is not greatly affected neither by UV radiation nor charged particles, but it is considerably accelerated by presence of atomic hydrogen.JRC.I.4-Nanotechnology and Molecular Imagin

Summary and Validation of New Animal-Free Toxicity Tests

Alternatives to animal testing have been developed mainly in the fields of toxicology and vaccine testing. Typical examples are the evaluation of phototoxicity, eye irritation, or skin corrosion resulting from cosmetics and industrial chemicals. Examples also can be found in other biomedical areas, however, including the control of the quality of drug preparations or for the control of the production process of biologics. For regulatory purposes, the quality, transferability, and predictivity of an alternative method need to be evaluated. This procedure often is called the “validation process” of a new method. It follows defined rules, and several governmental institutions have been established to perform, supervise, or advise on this process. As this often results in a delay of method implementation, different alternatives for the evaluation of a method’s suitability and quality are subject to discussion. We describe here the principles of model development and quality control. We also give an overview of methods that have undergone validation. Strengths and shortcomings of traditional approaches are discussed, and new developments and challenges are outlined

Removal of Immune-stimulatory Components from Surfaces by Plasma Discharges

Immune-stimulating microbiological components like lipopolysaccharide (LPS), lipoteichoic acid (LTA) and zymosan bound onto surfaces lead to severe problems when brought in contact with the organism via surgical instruments or implants. We have shown in recent studies that it is possible to detect different immune-stimulating components directly on the surface, via the human whole blood model, which uses the monocyte reactions to measure the inflammatory mediator release (IL-1β) by ELISA. With regard to the inactivation of pyrogenic substances, we present a method based on the application of a low-pressure microwave plasma discharge working at low temperatures. We found a fast (10 s to a few minutes) removal rate for LPS, LTA and zymosan. To mimic the bacterial cell-wall, LPS in combination with muramyl dipeptide (MDP) was employed and the removal rate did not differ from pure LPS. In conclusion, we found that the human whole blood incubation test is a very sensitive method to detect residues of immune-stimulating components directly on the surface, without the problem of preparing eluates and related losses on the surface. Furthermore, we found that the low-pressure microwave discharge plasma is an appropriate method to eliminate various immune-stimulating components relatively fast, under low-temperature conditions preventing treated substrates from the heat-induced modifications and without necessity to use toxic compounds. This was demonstrated first for LPS, the most potent immune-stimulatory component that can be removed in a reliable way and with fast kinetics, even if the signal is synergistically increased by another substance. Gram-positive stimuli, which are gaining more and more importance, could be removed as well with a very fast removal rate. Also zymosan, as a well-introduced monocyte and macrophage stimulus, was removable to major extent.JRC.I.2-Validation of biomedical testing method

Low Pressure Plasma Discharges for the Sterilization and Decontamination of Surfaces

The mechanisms of sterilization and decontamination of surfaces are compared in direct and post discharge plasma treatments in two low-pressure reactors, microwave and inductively coupled plasma. It is shown that the removal of various biomolecules, such as proteins, pyrogens or peptides, can be obtained at high rates and low temperatures in the inductively coupled plasma (ICP) by using Ar/O2 mixtures. Similar efficiency is obtained for bacterial spores. Analysis of the discharge conditions illustrates the role of ion bombardment associated with O radicals, leading to a fast etching of organic matter. By contrast, the conditions obtained in the post discharge lead to much lower etching rates but also to a chemical modification of pyrogens, leading to their deactivation. The advantages of the two processes are discussed for the application to the practical case of decontamination of medical devices and reduction of hospital infections, illustrating the advantages and drawbacks of the two approaches.JRC.I.4-Nanobioscience