Untersuchung von Interaktionen G-Protein-gekoppelter Rezeptoren am Beispiel des humanen NPY5-Rezeptors mit Hilfe von Reflektometrischer Interferenzspektroskopie

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren spielen eine wesentliche Rolle bei der Signaltransduktion. Diese in der Zellmembran integrierten Proteine vermitteln eine Vielzahl einlaufender äußerer Signale, so dass die Zelle angemessen auf Veränderungen reagieren kann. Fehlfunktionen signalübertragender G-Proteine tragen zu Krankheiten wie Cholera, Keuchhusten, Krebs, Alzheimer, Parkinson oder Diabetes bei. Medikamente, die auf die Regulation eines bestimmten G-Protein-gekoppelten Rezeptors Einfluß nehmen können, sind daher von großem Interesse. Es wurde hier als Modellsystem für den Nachweis der Interaktionen von GPCRs mit den entsprechenden Targets der NPY-Rezeptor und das Neuropeptid Y, welches zur Familie der Pankreas-Peptide zählt, verwendet. NPY ist das im Gehirn am weitesten verbreitete Neuropeptid. Neben einer Vielzahl von Funktionen, die nicht im Zusammenhang mit der Regulierung der Nahrungsaufnahme stehen, ist es das potenteste orexigene Signal, d.h. es ist das stärkste Appetit-erzeugende Stimulans. Die bei den vorliegenden Messungen verwendete markierungsfreie, optische Transduktionsmethode der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie RIfS beruht auf der Mehrfachreflexion von Weißlicht an dünnen Schichten. Aus dem Interferenzmuster der reflektierten Strahlen wird die Änderung der optischen Schichtdicke zeitaufgelöst gemessen und es kann so zum Beispiel die Bindung eines Rezeptors an einen oberflächengebundenen Liganden verfolgt werden. Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei ca. 3 pg/mm2 Protein und ist somit für die Detektion der Interaktionen von Proteinen geeignet

Markierungsfreie Online-Detektion der Hybridisierung auf einem DNA-Chip : Detektionsmethode für den Gensensor

Die Genomforschung hat sich in den letzten Jahren verstärkt in Richtung neuer analytischer Methoden orientiert, um der großen Anzahl an notwendigen Experimenten durch parallele Ansätze zu begegnen. Der größte Entwicklungsschritt ist hierbei die Verwendung von sogenannten DNA-Chips, womit flächige Arrays aus immobilisierten DNA-Fragmenten beschrieben werden, die zu Anwendungen von der Expressionsanalytik (high density arrays) bis hin zu diagnostischen Chips (low density arrays) herangezogen werden. Die Detektion auf Arrays erfolgt in kommerziellen Geräten in der Regel fast ausschließlich durch Fluoreszenzemission von farbstoffmarkierten Oligonukleotiden an der Oberfläche. In mehreren Beispielen wurde bereits die Detektion der Hybridisierung auf markierungsfreien Biosensoren, jedoch nur in Einkanalmessungen, gezeigt, wie z.B. auf SPR (Biacore), Gitterkoppler oder RIfS (Reflektometrische Interferenzspektroskopie). Diese oberflächenbasierten Detektionsmethoden erfordern keinerlei Markierung der zu detektierenden Komponenten, d.h. es kann im Einzelfall direkt mit Extrakten oder Amplifikaten aus komplexen Matrices heraus gearbeitet werden. Der Schritt der Farbstoffmarkierung entfällt und damit entfällt auch die mögliche Beeinflussung der Wechselwirkung durch die Markierung, genauso wie die Beeinflussung der Fluoreszenzintensität an der Oberfläche durch unspezifische Quenchingefffekte oder auch Photobleaching. Im Bremer Forschungs- und Entwicklungsverbund Gensensorik wird mit dem Ziel einer industriellen Umsetzung des Gensensorik Konzeptes an einer Integration der DNA-Chiptechnologie in ein Gesamtkonzept aus Bioinformatik, biochemischer Fragestellung, Oberflächenchemie, Chipproduktion, Detektion und Datenauswertung/-bewertung gearbeitet. Im Rahmen dieses FuE Verbundeses wird die parallele und zeitaufgelöste Detektion von Hybridisierungsreaktionen an der Oberfläche mittels Reflektometrischer Interferenzspektroskopie auf das Chipformat übertragen

Parameter optimization for two detections systems for labelfree analysis of biomolecular interactions

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der nur eingebettet in seine Membran funktionell bleibt, und seinem Liganden zu ermöglichen und mit geeigneten Methoden zu untersuchen. Eine solche Charakterisierung erfolgte mit Biosensoren bisher noch nicht befriedigend, da diese Proteine schwer in eine lösliche Form gebracht werden können, ohne dass sie ihre Funktionalität verlieren. Eine Messung aus der Membranpräparation war mit rein brechungsindexsensitiven Methoden bisher schwer durchführbar. Hierzu sollten nun verschiedene Biosensoren grundsätzlich untersucht und verglichen, und bezüglich ihrer Eignung für die genannte Problemstellung gegenübergestellt werden. Dabei sollte besonders die Methode der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) auf ihre Eignung untersucht und zu diesem Zweck in den Gesamtzusammenhang optischer Biosensoren eingeordnet werden. Eine genaue Analyse der Leistungsparameter sollten im Vergleich zu bereits kommerzialisierten Verfahren eine Einordnung ermöglichen. Auch im Hinblick auf eine mögliche Kommerzialisierung der Methode RIfS sollten anhand höchster Anforderungen, gegeben durch die kinetische Charakterisierung eines Modellsystems, eine vergleichende Analyse gegenüber zweier ausgewählter kommerzialisierter und bekannter Technologien, der SPR und der Resonant-Mirror-Technik, repräsentiert durch das BIAcore 2000 und das IAsys plus, und ein Interferometersystem, das IBS 101 des IPM Freiburg, durchgeführt werden. Um die Leistungsparameter der RIfS abzuschätzen, sollte eine Signalkalibrierung anhand von spezifischer Bindung radioaktiv markierter Proteine durchgeführt werden. Um für das IBS 101, ein Prototyp eines Young-Interferometers, reproduzierbare Messungen der Wechselwirkungen von Biomolekülen zu ermöglichen, bestand jedoch zunächst die Notwendigkeit der Entwicklung einer organischen Schichtpräparation für eine reproduzierbare Immobilisierung von Biomolekülen an, welche innerhalb einer Kooperation gemeinsam mit einer Weiterentwicklung der Detektion und der Fluidik zum Bestandteil der Arbeit wurde.A goal of the work was the characterization of the interaction between a G-protein-coupled receptor, which is only stable embedded in the membrane, and its ligand. An analysis with the most appropriate method should be performed. A characterization with biosensors is difficult because the receptors are hardly soluble without the loss of activity. Measurements out of a membrane preparation with refractive sensitive methods have been difficult. Within this work some biosensors should be investigated and compared in regard to their applicability for the problem. Especially the Reflectometric Interference Spectroscopy (RIfS) as a non-commercial method should be analysed and compared. It has to be proofed by the use of a model system that the RIfS instrument meets the higher requirements of a kinetic measurement. Comparing analyses of RIfS, Surface plasmon resonance (SPR) and resonant mirror (RM), represented by two commercial instruments (BIAcore and IAsys) and a young interferometer (IBS 101, Fraunhofer Intitute Freiburg) have been carried out. To estimate the performance of the RIfS instrument a calibration has been carried out by the use specific interaction of radioactive labelled proteins. For the prototype of the young interferometer, the IBS 101, it became essential first to develop an organic layer system in order to ensure a reproducible immobilization of ligands. Also a further development of the fluidic system and the detection device together with the IPM Freiburg became part of the dissertation