Impacto del consumo de jugo de betarraga (Beta vulgaris L) en un modelo animal de dislipidemia

53 p.El síndrome metabólico es un grupo de alteraciones que aumentan el riesgo de desarrollar patologías como la aterosclerosis, obesidad, dislipidemias, presión arterial elevada y problemas en el metabolismo de los carbohidratos. Estos factores están altamente vinculados a la dieta y los estilos de vida. Se estima que una dieta rica en vegetales está asociada a un menor riesgo de desarrollar estos problemas anteriormente mencionados. Se ha propuesto que estos efectos beneficiosos estarían vinculados al alto contenido de nitratos de estos alimentos contraponiéndose a la idea de que los nitratos y derivados podrían ser causantes de algunas formas de cáncer. La betarraga (Beta vulgaris L) es una hortaliza de la familia de las quenopodiáceas. Esta hortaliza es rica en nitratos y moléculas antioxidantes como las betalainas y el acido ascórbico. En este trabajo se evaluó el impacto del jugo de betarraga (rico en nitrato) sobre el perfil lipídico del ratón knock out de ApoE, un modelo de dislipidemia. El jugo se administró como bebida durante 9 semanas. Los animales se dispusieron en 4 grupos de estudio; un grupo de ratones ApoE que recibió jugo de betarragas como bebida, un grupo ApoE que recibió agua, un grupo de ratones silvestres que recibió agua y otro grupo de ratones silvestre que recibió jugo. Siendo 10 mL la cifra promedio de jugo y agua bebida por grupo. Los ratones ApoE -/- que recibieron jugo de betarragas redujeron significativamente sus niveles plasmáticos de colesterol total, aumentaron sus niveles de colesterol HDL, sin cambios en sus niveles de triglicéridos y VLDL. Estos resultados sugieren que una dieta rica en nitratos de origen vegetal podría tener un efecto benéfico sobre el metabolismo lipidico cuando este está alterado. De esta manera, es posible pensar que dietas que incluyan nitratos de origen vegetal podrían tener un impacto positivo en personas con dislipidemia. Se deben diseñar nuevos estudios que corroboren esta hipótesi

Estudio de la reactividad vascular en aortas de ratones deficientes en APO-E

64 p.La aterosclerosis es una afección crónica, causa de diversas enfermedades cardiovasculares. Su etiología multifactorial desencadena un proceso pro-inflamatorio que termina en el daño de los vasos sanguíneos. La disfunción endotelial, caracterizada por un desbalance en la producción de factores relajantes y contráctiles derivados del endotelio, se reconoce como un paso previo al desarrollo de aterosclerosis.Se investigó la reactividad vascular en ratones deficientes en ApoE (ApoE+/- como modelo de dislipidemia y disfunción endotelial) alimentados con dieta normal y se los comparó con ratones Wild type (C57B1/6). Para esto se extrajo la arteria aorta de los ratones y se trabajó con la técnica de los anillos aórticos, la cual fue optimizada antes de comenzar la investigación. La reactividad vascular se midió a través la relajación de los anillos aórticos con acetilcolina (0,01, 0,1; 1, 5 y 10 μM) previa contracción con fenilefrina 5μM. La viabilidad de las preparaciones fue corroborada antes de la contracción con fenilefrina, mediante la aplicación al sistema de 60 mM de KCl.La técnica fue exitosamente optimizada y permitió llevar a cabo el estudio. Los resultados mostraron que los anillos aórticos de los ratones deficientes en ApoE contrajeron más que los WT frente a KCl (p = 0,0383), siendo la tensión de precarga óptima a 1,5 g para ambos grupos. La contracción con fenilefrina no mostró diferencias significativas entre ambos grupos, mientras que la relajación inducida por acetilcolina fue menor en ratones ApoE+/- que en ratones Wild type (p= 0,005). Estos datos sugieren una posible disfunción endotelial en los ratones ApoE+/-

Impacto de la inhibición de S-nitrosoglutatión reductasa en la S-nitrosilación del miocardio

68 p.El óxido nítrico (NO) es un importante mensajero celular implicado en diversos mecanismos de cardioprotección. Si bien puede actuar a través de distintas vías de señalización, nos enfocaremos en su capacidad de producir S-nitrosilación (SNO), es decir modificar postraduccionalmente a los grupos tiol (SH) de cisteína de una proteína y generar un enlace covalente. A través de este mecanismo, se protege a las proteínas clave para la sobrevida celular, modificando ya sea su actividad, morfología o ubicación de forma transitoria y evitando su oxidación permanente. Dentro de los mecanismos de regulación de la SNO, destaca el sistema denitrosilante S-nitrosoglutatión reductasa (GSNOR), el cual controla la SNO a través de Snitrosoglutatión (GSNO), molécula receptora de los grupos NO desde proteínas nitrosiladas, a través del cual se reducen los niveles de SNO en la célula. En este estudio se llevó a cabo la inhibición farmacológica de la enzima GSNOR con el compuesto conocido como C2 a una concentración de 1μM en tejido cardiaco de rata en condición basal, con el propósito de detectar el aumento de las SNOs a través de una técnica análoga al Biotin switch en la cual se somete al tejido a un proceso de bloqueo de tioles libres, tras lo cual se transforman los nitrosotioles a tioles mediante transnitrosación con ascorbato y finalmente se añade el reactivo de marcaje yodo-TMT (biotina en Biotin switch ) para visualizar el resultado a través de un western blot utilizando un anticuerpo anti yodo-TMT. Los resultados nos permitieron evidenciar el incremento de las proteínas Snitrosiladas en tejido cardiaco normal, destacando la reproducibilidad y especificidad que mostró el ensayo de nitrosilaciones en este estudio

Determinación de NOX-2 y NOX-4 en miocardio de ratas, analizando su relación con la cardiopatía diabética

69 p.La diabetes corresponde a una patología altamente prevalente tanto a nivel nacional como internacional. Dentro de sus complicaciones encontramos la cardiopatía diabética, siendo una de las mayores causas de mortalidad de la enfermedad. Esta complicación se relaciona con la mayor producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), lo cual se encuentra modulado por el complejo NAPDH oxidasa, por la respiración mitocondrial y por la Angiotensina II. Estos modulares provocan una regulación positiva de las ROS. La familia de las NAPDH oxidasas, ahora denominadas NOXs comprenden variadas isoformas, donde podemos destacar NOX-2 y NOX-4, a nivel cardiaco.En este estudio se llevó a cabo la pesquisa de NOX-2 y NOX-4 determinando su expresión génica a través del ARNm, estudiado en un modelo de diabetes; ratas control (C), ratas diabéticas (inducido por aloxano) sin ejercicio físico (S) y ratas diabéticas (inducido por aloxano) sometidas a ejercicio físico (E). El ARNm fue extraído del tejido cardiaco con el método del TRIZOL. Luego de ello se realizó la transcripción del ARNm a ADNc, para finalmente continuar con la cuantificación del transcrito por medio de la PCR-real time. Finalmente, los resultados obtenidos (CTs) nos permitieron analizar los datos comparando la producción de ARNm entre los distintos grupos estudiados,pudiendo concluirse, que el ejercicio físico no disminuía la producción de ARNm para NOX hallándose aumentada tanto NOX-2 como NOX-4, en comparación a las ratas diabéticas sedentarias y las ratas control. Palabras claves: NOX-2,NOX-4 , NAPDH, PCR-real time, Cardiopatía Diabética, / ABSTRACT: Diabetes corresponds to a highly prevalent pathology both nationally and internationally. Among its complications diabetic cardiomyopathy is one of the main causes of mortality of the disease. This complication is associated with increased production of reactive oxygen species (ROS), which is modulated by the NADPH oxidase complex, mitochondrial respiration and Angiotensin II. These cause upregulation of ROS. The family of NADPH oxidases, now called NOXs, comprises various isoforms, where NOX-2 and NOX-4 are the most important in the heart. In this study we conducted the investigation of NOX-2 and NOX-4 determining gene expression through mRNA, studied in a model of diabetes; control rats (C),diabetic rats (induced by alloxan) without exercise (S) and diabetic rats (induced by alloxan) subjected to physical exercise (E). mRNA was extracted from the cardiac tissue with the Trizol method. After the mRNA isolation, the transcription to cDNA was performed. Finally the amount of NOXs transcript was quantified by real-time PCR.The results obtained (CTs) allowed us to analyze the data comparing mRNA production between the different groups studied. It can be concluded that exercise did not decrease the production of mRNA for NOX. On the contrary, it is associated with an increase in both NOX-2 and NOX-4 mRNA in exercised rats compared to sedentary diabetic rats and control rats. Keywords: NOX-2, NOX-4, NAPDH, PCR-real time, Diabetic cardiopathy, Diabetes

Óxido nítrico sintasa endotelial en ratones deficientes en Apolipoproteína E.

68 p.La aterosclerosis, agrupada dentro de las enfermedades cardiovasculares, corresponde a una patología que puede afectar a vasos sanguíneos de diferente calibre, disminuyendo el diámetro normal que posibilita la circulación sanguínea, lo que ocurre por una acumulación de lípidos, colesterol, fibrina y células del sistema inmune en la pared de los vasos. El evento previo a la formación de placas de ateroma o aterosclerosis es la disfunción del endotelio, en la cual existe un desequilibrio en la producción de las sustancias vasoactivas sintetizadas por él. Una de las moléculas que mayormente se ve afectada y que cumple un importante rol tanto en la regulación del tono vascular como en la protección del endotelio vascular, es el óxido nítrico sintetizado por la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), quien ve mermados tanto su contenido como su actividad. El objetivo planteado es determinar y comparar contenido de eNOS de tejido cardiaco de ratones deficientes en Apolipoproteína E (ApoE+/-), un modelo animal de dislipidemia, y de ratones control, sometidos a dieta normal. Las metodologías utilizadas y estandarizadas fueron: la determinación de contenido proteico de tejido cardiaco de ratones ApoE+/- y sus controles, mediante método del ácido bicinconínico (BCA); SDS-PAGE y Western blot, para determinar el contenido de eNOS, eNOS fosforilada, caveolina y tubulina; además la determinación de producción de NO mediante la determinación de contenido de nitrato y nitrito, por el método de Griess. A partir de los resultados obtenidos en esta memoria, se concluye que existe unadisminución del contenido de eNOS en los ratones deficientes en ApoE, sin embargo su actividad no está disminuida, ya que si bien, mediante Western blot se encontró menor contenido de eNOS en tejido cardiaco de ratones ApoE+/-, estos tienen una mayor proporción de eNOS fosforilada y por lo tanto tienen niveles de nitrato y nitrito similares a los ratones control

Efecto del envejecimiento en el acoplamiento excitación-contracción cardíaco en ratas.

59 p.El ion calcio (Ca2+) participa en una gran cantidad de funciones a nivel celular de importancia fisiológica, como por ejemplo actuando como segundo mensajero, en la propagación de estímulos eléctricos, en la secreción celular, apoptosis, y por último en el acoplamiento excitación-contracción en las fibras musculares cardiacas. El presente trabajo tuvo por objeto determinar como se ve influenciado el acoplamiento excitación-contracción cardiaco por el envejecimiento y que efecto tendría la inhibición farmacológica del sistema generador de superóxido NADPH oxidasa (NOX) mediante apocinina. Se utilizó ratas machos jóvenes (5 meses) y senescentes (20 meses) de la cepa Sprague-Dawley para la obtención de los corazones. De estos se obtuvo cardiomiocitos aislados. La determinación experimental se llevó a cabo mediante la cuantificación de Ca2+ a través de fluorescencia usando el compuesto fluoróforo sensible a Ca2+ Fura 2AM. La determinación de Ca2+ se realizó a nivel citoplasmático y se vió el efecto en la sensibilidad de los miofilamentos por Ca2+ y por último se evaluó la contractilidad de la célula cardiaca mediante el grado de acortamiento de los sarcómeros. Se encontró que en cardiomiocitos senescentes aumenta el Ca2+ citoplasmático y se enlentece la cinética del Ca2+ y de la contracción y se vió una disminución de la sensibilidad de los miofilamentos al Ca2+. La inhibición de NOX en cardiomiocitos senescentes aumentó el Ca2+ citoplasmático y mejoró la cinética de Ca2+

Contractilidad del miocito cardiaco: rol de (NOS)

48 p.El óxido nítrico presenta diversos papeles en numerosas vías de transducción de señales intracelulares, principalmente actuando sobre la función cardiaca. La producción de esta molécula puede ser tanto enzimática como química, siendo la enzimática la más importante vía óxido nítrico sintasa (NOS). Este trabajo, tiene como finalidad evaluar el comportamiento in vitro de células cardiacas de ratón, tanto en estado basal y en respuesta a un agente estimulador de los receptores beta adrenérgicos, como también evaluar el efecto en la célula cardiaca de la inhibición de la óxido nítrico sintasa 1. Este comportamiento a nivel celular se caracterizó utilizando un fluoróforo de calcio (fura 2), por medio de fluorimetría, en donde se podrá visualizar en tiempo real los niveles de calcio intracelular y por microscopía el modo y grado de acortamiento del sarcómero del cardiomiocito.Se encontró que los cardiomiocitos de ratón respondieron frente a un aumento de frecuencia de estimulación (de 1 a 4 Hz) con una mantención en el grado de acortamiento de sarcómeros y en la amplitud de los transientes de calcio. Por otra parte,los cardiomiocitos respondieron con un aumento en el grado de acortamiento y en la amplitud en los transientes de calcio cuando fueron estimulados con isoproterenol (1μM). Este aumento disminuyó significativamente (p<0,05) cuando las células fueron tratadas con un inhibidor de la oxido nítrico sintasa 1 (S-metil tiocitrulina)

La inhibición farmacológica de la NADPH oxidasa reduce la fibrosis cardíaca en un modelo animal de distrofia de Duchenne

68 p.La enfermedad distrofia de Duchenne corresponde a una alteración genética que provoca una disrupción del complejo distrofina-glicoproteína provocando la debilitación del sarcolema y desgarros en la membrana. La proteína distrofina se encuentra presente en todos los músculos estriados y además en musculo cardíaco. Debido a esto, es una enfermedad que se presenta con consecuencia graves como desarrollo de perdida habilidad motora muscular, debilidad muscular, que comienza a generar una imposibilidad a caminar y luego de los 20-30 años puede presentarse en el paciente insuficiencia cardíaca, hasta cardiomiopatías graves.Hasta el día de hoy no se ha presentado una cura, sino más bien cuidados paliativos. Es debido a esto último que se han dirigido una gran cantidad de estudios en busca de tratamiento específico y selectivo para que de esta manera se le otorgue al paciente con esta enfermedad mayores opciones terapéuticas y una mejor calidad de vida.Uno de los principales contribuyentes en el progreso hacia una cardiomiopatía en los pacientes con la enfermedad de Duchenne, es la sobreproducción de especies reactivas de oxigeno (ROS), en donde el mayor generador de estas especies corresponde al complejo NADPH oxidasa. Es por esto y en base a estudios anteriores que el presente trabajo pretende demostrar un rol beneficioso de la administración de un inhibidor selectivo del complejo NADPH oxidasa y el impacto que generara la utilización en modelos animales que presentan la enfermedad de Duchenne, denominados ratones Mdx

Cardioprotección basada en la S-nitrosilación de proteínas implicadas en la actividad mitocondrial

80 p.El óxido nítrico (NO) es una molécula lábil sintetizada por un grupo de isoenzimas denominadas óxido nítrico sintasas (NOS). se le considera un mensajero intracelular cuya complejidad en sus mecanismos de transducción de señales ha logrado un alto grado de importancia debido a su capacidad de lograr modificar la actividad, estructura y estabilidad de muchas proteínas, modulando la fisiología de muchos tipos celulares, efecto basado principalmente en dos mecanismos de señalización: uno indirecto (dependiente de GMPc) y otro directo (independiente de GMPc), que es comúnmente conocido como S-nitrosilación (S-NO), una modificación post-traduccional que consiste en la formación de un enlace covalente reversible entre un grupo tiol de cisteína y un grupo NO. En el presente trabajo se evaluó la S-nitrosilación presente en el corazón de ratas expuesto a un inhibidor farmacológico de la actividad de la S-nitrosoglutatión reductasa (GSNOR), una enzima desnitrosilante que regula negativamente la generación de enlaces nitroso-tioles. Para esto se detectó la S-nitrosilación mediante el método de “Switch de biotina”. Se encontró un aumento de proteínas S-nitrosiladas, principalmente en aquellas que son clave en los procesos de actividad mitocondrial, así como VDAC-1, unidades F0/F1 ATPasa o proteínas de la cadena transportadora de electrones. Se observó que la inhibición de GSNOR genera un efecto que tiende al aumento de proteínas-SNO, encontrando que las proteínas mitocondriales tienden a un aumento de esta modificación postraduccional, especialmente de VDCA-1, proteína que puede tener cierta relevancia como factor cardioprotector en procesos isquémicos

Moléculas híbridas de isoxazol y tetrahidroquinolina: posibles inhibidores del poro de transición de permeabilidad mitocondrial

72 p.La mitocondria es un orgánulo celular involucrado en una gran cantidad de procesos fisiológicos y patológicos, razón por la que es ampliamente estudiada. Se describe que participaría en procesos de isquemia reperfusión en donde una sobrecarga de Ca+2 mitocondrial causaría la apertura de un poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP), el cual gatillaría una desregulación de la producción de energía de la célula, pérdida del potencial de membrana y con ello la muerte celular. Si bien actualmente no se conoce a cabalidad las estructuras que conforman este poro, las investigaciones actuales se centran en la búsqueda de posibles inhibidores, para así evitar la muerte celular. El objetivo de este trabajo se basa en la búsqueda de moléculas hibridas de isoxazol y tetrahidroquinolina que logren inhibir la apertura del mPTP, para lograr disminuir y eventualmente prevenir el grado de afección que se produce en las células frente a la apertura prolongada de este poro. Se utilizaron 12 ratas de la cepa Sprague – Dawley. A partir de ellas se extrajo el hígado y por consiguiente las mitocondrias mediante un proceso de centrifugación diferencial, para posteriormente realizar el estudio de la apertura de mPTP, llevado a cabo a través del ensayo de hinchazón (swelling). La ciclosporina A (CsA) no inhibe la apertura del mPTP frente a la administración de CaCl2 en un rango de 200 a 1000 μM. Las moléculas hibridas de isoxazol y tetrahidroquinolina, 1-[2-(5-Metil-isoxazol-3-yl)-6-nitro-1,2,3,4-tetrahidro-quinolin-4-yl]-pirrolidin-2-ona (molécula 2) y 1-(2-Isoxazol-3-yl-1,2,3,4-tetrahidro-quinolin-4-yl)-pirrolidin-2-ona (molécula 3), logran inhibir la apertura del mPTP frente a una concentración de CaCl2 600 μM con un valor p<0,05. Palabras claves: Mitocondria - mPTP - ensayo de swelling - isoxazol – tetrahidroquinolin