Avaliação de um novo kit (TF-TEST) nacional destinado ao diagnostico de enteroparasitoses em amostras fecais

Orientadores: Luiz Candido de Souza Dias e Sumie Hoshino ShimizuDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: As enteroparasitoses humanas constituem atualmente um dos problemas de saúde pública tanto para países em desenvolvimento como para países desenvolvidos, em virtude do aumento no número de viajantes a regiões endêmicas e principalmente por causa de indivíduos imunocomprometidos. Devido aumentar a probabilidade do encontro de organismos pelo exame de amostras múltiplas, pelo menos três exames parasitológicos das fezes são necessários, a fim de obter resultados sensíveis. Desta forma, idealizamos e desenvolvemos um kit (TF-Test) prático e econômico, agora em vias de ser fabricado em escala industrial, por uma empresa (Immunoassay Ind. Com. Ltda., São Paulo, Brasil). Este kit possibilita, em dias alternados, a coleta de três amostras fecais, separadamente, em tubos contendo uma solução preservadora. No laboratório, as três amostras são processadas em uma só etapa, utilizando um conjunto, onde a mistura passa por duplo filtro, e é concentrada por uma centrifugação rápida. O presente trabalho trata sobre avaliações dos protótipos do kit realizadas em duas fases, sendo a primeira, intralaboratorial abrangendo um período de seis meses, e a segunda, interlaboratoriais de dois anos. Na primeira fase, a técnica de TF-Test foi avaliada no estudo de 30 pacientes com parasitoses intestinais e 30 sem infecção parasitária, obtendo uma sensibilidade de 96,6%, significativamente (p < 0,05) maior que as demais técnicas convencionais comerciais (Coprotest, StillQuick e Parasep) ou não (Lutz ou Hoffman, Pons & Janer). Ademais, a técnica em questão apresentou um elevado índice de concordância k (0,920), considerado como Quase Perfeito, diferindo das técnicas convencionais. Em vista do potencial uso do protótipo para finalidade diagnóstica, o trabalho teve continuidade na segunda fase, onde os protótipos aprimorados foram avaliados no estudo de 1.244 pacientes em seis diferentes laboratórios de setor público e privado, considerados como sendo de referência ou altamente conceituados. Os dados obtidos demonstram que a técnica de TF-Test é de fato melhor que as técnicas convencionais utilizadas (Coprotest, Lutz e associação de Lutz, Faust & Cols. e Rugai, Mattos & Brisola), por apresentar sensibilidades que variam de 82,6% a 100%, estatisticamente maiores (p < 0,05) que as técnicas convencionais. Em quatro laboratórios, o índice k de TF-Test teve a classificação de Quase Perfeito e em dois laboratórios, Substancial. A alta sensibilidade e os aspectos econômicos e práticos demonstram que a técnica de TF-Test é apropriada para diagnóstico individual, inquéritos populacionais, assim como, para avaliação de quimioterapia instituída em programas de controle das parasitoses intestinaisAbstract: Human intestinal parasitoses constitute a serious public health problem either in developing or developed countries. Those enteroparasitoses could be attributed to the increase of travelers around endemic areas and mainly due to immunocompromised patients. In order to obtain sensible results and to have a high chance to find organisms by multiple sample exams, it is necessary at least three serial parasitologycal faecal tests. For these reasons, a practice and non-expensive kit (TF-Test) was developed for being industrialized by a specialized company (Immunoassay Ind. Com. Ltda., Sao Paulo, Brazil). This kit makes possible to carry out three different faecal samples each other day. The three faecal samples are separately collected into tubes containing a preservative solution. Laboratory evaluation is done in just one step by using a pool of the three faecal samples. Mixture mass is passing by a double filter and then centrifuged for concentrating the mixture. Thus, the present study reports about evaluations of a prototype kit developed into two different phases: first phase was a six months stage inside developer laboratory and, the second one was a two years stage involving six different collaborative laboratories. In the first phase, parasitologycal exams using TF-Test was carried out in 30 patients with intestinal parasites and in 30 patients free of intestinal parasites and, it was significantly more sensible (96,6%, p<0,05) compared with conventional techniques as Coprotest, StillQuick e Parasep or with those frequently used as Lutz or Hoffman, Pons & Janer. Furthermore, TF-Test had a high agreement k index (0,920), which was considered as Almost Perfect, in addition to differ from conventional techniques. Thus, focusing in the potential use of TF-Test for diagnosing different intestinal parasites, this work had been continued for developing a better prototype kit of TF-Test. In the second phase, six different specialized laboratories from public or private service had evaluated faecal samples collected from 1.244 patients. Data from those laboratories attested that TF-Test was actually better than other known techniques (Coprotest, Lutz and Lutz, Faust & Cols. and Rugai, Mattos & Brisola), for presenting sensibility range between 82,6% and 100%, which was significantly higher than conventional methods (p < 0,05). In four of the six laboratories, k index of TF-Test was classified as Almost Perfect, and in the other two laboratories, the index was considered as Substancial. The high sensibility of TF-Test in addition to its practice and economic aspects shown that TF-Test method is very appropriated for individual diagnosis, population inquires as well as for evaluating therapy programs in the control of intestinal parasitosesMestradoParasitologiaMestre em Parasitologi

Processing of samples feces and development of the technique of analyses of images for computer, for the diagnosis of the enteroparasitoses

Orientador: Alexandre Xavier FalcãoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: No presente trabalho, averiguamos sobre processamentos de amostra fecal, desenvolvimento e avaliação de um sistema de computador para análise de imagem parasitária. Observamos que a etapa de processamento de fezes consistiu a etapa crítica, mas, essencial para o fornecimento de estruturas parasitárias limpas, com reduzida quantidade de microimpurezas fecais, ao sistema de análise por computador. Algumas técnicas parasitológicas convencionais, utilizando ou não kits comerciais, foram estudadas, e a de TF-Test (Three Fecal Test) apresentou menor teor de microimpurezas no final de processamento fecal. Todavia, este teor de microimpurezas era ainda muito grande, sendo ainda inadequado para análise computacional. Modificações foram introduzidas à técnica de TF-Test, com coloração dos componentes do sedimento fecal, utilizando um corante desenvolvido à base de Lugol, e seguido por degradação alcalina de microimpurezas, com uma solução clarificadora, previamente padronizada. Assim, a técnica de TF-Test Modificada contribuiu para o fornecimento de parasitos com poucas microimpurezas. O desenho do protótipo do sistema computacional para a análise de imagens incorporou: a técnica de TFTest Modificada; um microscópio óptico adaptado a uma bomba sucção peristáltica para conduzir uma alíquota de suspensão fecal processada à uma lâmina ou câmara tubular, onde estruturas parasitárias ou não apareciam em imagem; uma câmera digital; um monitor de vídeo para regulagem e captura de imagens; e um computador. Um banco de imagens foi construído, após coletas de amostras fecais foram efetuadas previamente em 4 regiões diferentes (Campinas, Botucatu, Avaré e Piraju) do estado de São Paulo, onde as enteroparasitoses são prevalentes. Os procedimentos de biossegurança e controle de qualidade contribuíram para que a perda da amostra fecal fosse pequena, não ultrapassando de 8%. Foi obtido um total de 16 espécies parasitárias, constituídos de helmintos e protozoários, e estes proveram uma coleção de 1.126 imagens ao computador. Ademais, o banco de imagens foi formado por informações adquiridas de 5.626 componentes parasitários e não parasitários, assim como, de dados sobre suas características de forma, textura e cor. A análise computacional baseou-se em um sistema de pipeline de técnicas de processamento de imagens, incluindo o uso de uma técnica denominada de Image-Foresting Transform (IFT). O pipeline consistiu em técnicas de segmentação de imagens para separar estruturas parasitárias e impurezas do fundo das imagens; em técnicas de extração para codificar características da forma, da cor e da textura dos parasitos; e em técnicas de reconhecimento e delineamento de imagens, visando distinguir parasitos de microimpurezas, de acordo com suas características próprias. A técnica de análise de imagens por computador (CIA) foi avaliada em comparação com a técnica de TF-Test Modificada de microscopia óptica, demonstrando alta sensibilidade de 95,3%, especificidade de 96,4%, e eficiência de 96,2 %. O conceito de concordância observada entre as duas técnicas estudadas foi de Quase Perfeito, em virtude do índice kapa (k) ter sido elevado, de 0,88. Esta técnica demonstrou ser altamente reprodutível, quando se ensaiaram em 10 diferentes ocasiões. Os achados deste trabalho apresentam perspectivas para industrialização do protótipo aqui desenvolvido, causando impacto na área de Saúde Pública, pois, no exame de fezes para população, há uma forte demanda de um sistema de automatização para detecção de enteroparasitosAbstract: In the present study, we investigated on fecal sample processings, development and evaluation of a computer system for parasite image analysis. We observed that the fecal processing step was critical, but, essential for providing clean parasite structures, with reduced amount of fecal microdebris, to the system of computer analysis. Several conventional parasitologic techniques, using or not commercial kit, were studied, and TF-Test (Three Fecal Test) showed lower rate of microdebris at the end of fecal processing. However, this microdebris rate was still great, being unsuitable for computer analysis. The TF-Test technique was modified by staining the fecal sediment components, with a Lugol-based stain, followed by an alkaline degradation of fecal microdebris, using a clarifyer solution. So, the modified TF-Test technique became capable to supply parasite structure with little fecal microdebris. The prototype design of the computer system for the image analysis incorporated: the modified TF-Test technique; a optical microscope coupled to a peristaltic suction pump for leading an aliquot of processed fecal suspension to the tubular slide or chamber, where the parasite structures or microdebris appeared in tridimensional images; a digital camera; a video monitor to calibrate and capture images; and a computer. An image database was formed, after collecting fecal samples from prevalent regions (Campinas, Botucatu, Avaré and Piraju) of the State of São Paulo for enteroparasitosis. The total fecal sample loss was low, being less than 8%, since biosecurity and laboratory quality control protocols were frequently checked. A total of 16 parasite species were identified, consisting of helminths and protozoans, which provided a collection of 1.126 parasite images to the computer. Moreover, the image database was formed by information acquired from 5.626 parasite and nonparasite components, in addition to data on their shape characteristics, texture and color. The computational analysis was based on a pipeline of image processing techniques, including the use of a technique known as Image-Foresting Transform (IFT). The pipeline consisted of: a technique for image segmentation, in order to separate parasites and microdebris from background image; a technique for feature extraction to encode shape, color and texture characteristics of parasites; and techniques for pattern recognition and delineation, permitting to distinguish parasites from microdebris, according to their own features. The technique of computer image analysis (CIA) was evaluated in comparison with the optical microscope technique, named modified TF-Test, demonstrating a high sensitivity of 95,3%, specificity of 96,4% and efficiency of 96.2%. The agreement between two techniques was ranked as Almost Perfect, since the kappa (k) index has been high as much as 0.88. This technique proved to be reproducible, in a study, in which the assay was repeated 10 times, in different occasions. Our findings present good perspectives for the industrial production of the here developed prototype, causing impact on the Public Health area, since, in the fecal examination of the population, there is a strong demand for an automated system of enteroparasite detectionsDoutoradoDoutor em Parasitologi