Estudio de los mecanismos que coordinan la actividad de los centros organizadores de microtúbulos de las células animales

La organización del citoesqueleto de microtúbulos (MTs) así como el control del número absoluto de éstos es esencial en la regulación de diferentes procesos celulares tales como la división celular, el trasporte direccional de proteínas o el establecimiento de la polaridad celular. La distribución de esta red no se establece de forma aleatoria, sino que depende de la localización y activación de los sitios intracelulares desde donde los MTs son nucleados. Esta nucleación tiene lugar en estructuras morfológicas definidas que se denominan centros organizadores de microtúbulos (MTOCs) (Lüders and Stearns 2007). En células animales en división, el centrosoma actúa como el principal MTOC celular (Bornens 2002), sin embargo, el Aparato de Golgi (AG) también presenta capacidad para nuclear MTs en células en interfase (Efimov et al. 2007). La actividad de estos dos sitios de nucleación de MTs varía a lo largo del ciclo celular sugiriendo la existencia de algún tipo de regulación coordinada de sus respectivas actividades. AKAP450, CDK5Rap2 y pericentrina (PCNT) son tres de las principales proteínas descritas como posibles reguladoras de dicho mecanismo de nucleación y presentes en ambos orgánulos. Así, en esta tesis, hemos llevado a cabo un análisis de los mecanismos implicados en el control del comportamiento coordinado de los diferentes MTOCs celulares combinando la eliminación de estos tres principales factores reclutadores de complejos γTuRC (AKAP450, CDKRap2 y PCNT) y el uso del recientemente descubierto inhibidor de PLK4 (proteína esencial en la duplicación del centrosoma) centrinona. Los resultados presentados demuestran que las proteínas implicadas tradicionalmente en el reclutamiento de complejos γTuRC no son esenciales para la nucleación de MTs desde el centrosoma en interfase; mientras que sí van a controlar esta función en el AG. Varias líneas argumentales apoyan esta conclusión. Primera, la inhibición de la expresión de AKAP450, CDK5Rap2 y PCNT en células hTERTRPE1 no afecta a los niveles de nucleación desde el centrosoma ni al reclutamiento de γ-tubulina. Centrosomas carentes de las tres proteínas son capaces de nuclear MTs a ratios normales gracias a la función de CEP192; quién sí parece ejercer una contribución importante pero no esencial en este mecanismo. Segunda, células carentes de estas cuatro proteínas aún presentaban cierta capacidad de nucleación de MTs desde el centrosoma, lo que demuestra la existencia de mecanismos adicionales a los generalmente considerados cómo canónicos. Tercero, en el caso del AG, es ya conocido que su capacidad para nuclear MTs depende de la presencia de AKAP450 (Rivero et al. 2009), y nuestros resultados demuestran que tanto CDK5Rap2 como pericentrina también influyen en estos niveles. Así, células carentes de CDK5Rap2 presentaban una menor capacidad de nucleación desde el AG mientras que en el caso de la ausencia de pericentrina, esta actividad se veía claramente potenciada; lo que indica el papel inhibitorio de la proteína. Ensayos de coinmunoprecipitación revelaron la existencia de dos tipos de complejos capaces de reclutar γTuRCs; aquellos basados en AKAP450 y los basados en pericentrina. Ambos desempeñan funciones antagónicas en los mecanismos de nucleación desde el AG y son totalmente dispensables en el papel del centrosoma como MTOC. Es conocido que en procesos de diferenciación celular los diferentes MTOCs experimentan mecanismos de desregulación, permitiendo potenciar o limitar su actividad de manera controlada. Nuestros resultados apoyan la idea de que la nucleación de MTs es un proceso con una jerarquía intrínseca en la que el centrosoma ocupa un lugar principal. Ensayos con la droga centrinona RESUMEN 10 demostraron que la ausencia de centrosoma provoca una estimulación significativa de la nucleación de MTs desde el AG; mientras que la presencia de centrosomas extras inhibe dicho mecanismo. Así, la pérdida o ganancia de centrosomas tiene un impacto en el comportamiento como MTOC del AG; situación que no ocurre de forma inversa como por ejemplo cuando se inhibe la nucleación de MTs desde el AG mediante la eliminación de AKAP450. Dado que la ausencia de PCNT estimula la capacidad de nucleación del AG de forma similar a cómo lo hace la ausencia del centrosoma, aunque en menor grado; nuestros datos parecen indicar que el efecto regulatorio del centrosoma sobre la función del AG podría estar mediado por el reclutamiento de la propia pericentrina a esta localización. En este sentido, nuestros experimentos también revelaron cómo los MTs son nucleados en células con sus dos principales MTOCs inactivos. Así, en estas condiciones, observamos la formación de estructuras acentriolares bien definidas capaces de nuclear MTs desde localizaciones discretas no asociadas ni al AG ni al centrosoma. El análisis en profundidad de dichas estructuras reveló que estos MTOCs acentriolares no se originan por un simple incremento de los niveles citoplásmicos o la localización ectópica de las proteínas centrosómicas; sino que presentan un claro ensamblaje regulado siendo la pericentrina un componente esencial y necesario para su conformación. En todos los casos, el proceso de nucleación siempre era dependiente de γ-tubulina. Finalmente, los estudios con centrinona mostraron que bajo cualquier condición experimental que implicara la ausencia de centrosomas, la densidad de MTs celular se duplicaba en comparación a las condiciones controles. Incremento que se observa independiente del sitio desde donde los MTs son nucleados; ya sea el AG (células controles tratadas con centrinona) o los MTOCs citoplásmicos (células akap450 knock-out sin centrosoma). Estos datos indican que el centrosoma parece controlar el número absoluto de MTs existente en la célula, así como la distribución espacial de éstos, no sólo por medio de un proceso de nucleación activa, sino en parte también al actuar a modo de regulador negativo de la actividad de los demás MTOCs alternativos. Sorprendentemente, este incremento de la densidad de MTs generada por la ausencia de centrosomas no se repite en células carentes de pericentrina, sugiriendo que ésta constituye un factor clave en la conexión y regulación del efecto que la pérdida del centrosoma tiene en la capacidad de nucleación de MTs desde el AG. Así, en este trabajo revelamos la existencia de un mecanismo mediante el cual el centrosoma es capaz de controlar el número y la distribución espacial de los MTs de células en interfase. Regulación que lleva a cabo no sólo controlando su propia actividad, sino también la de otros MTOCs alternativos; especialmente el AG. Por su parte nuestros resultados parecen también indicar que la pericentrina desempeña un papel esencial en esta regulación, actuando a modo de coordinador global del conjunto del proceso de nucleación de MTs

Estudio de los mecanismos que coordinan la actividad de los centros organizadores de microtúbulos de las células animales

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad de Sevilla.--2020-02-05La organización del citoesqueleto de microtúbulos (MTs) así como el control del número absoluto de éstos es esencial en la regulación de diferentes procesos celulares tales como la división celular, el trasporte direccional de proteínas o el establecimiento de la polaridad celular. La distribución de esta red no se establece de forma aleatoria, sino que depende de la localización y activación de los sitios intracelulares desde donde los MTs son nucleados. Esta nucleación tiene lugar en estructuras morfológicas definidas que se denominan centros organizadores de microtúbulos (MTOCs) (Lüders and Stearns 2007). En células animales en división, el centrosoma actúa como el principal MTOC celular (Bornens 2002), sin embargo, el Aparato de Golgi (AG) también presenta capacidad para nuclear MTs en células en interfase (Efimov et al. 2007). La actividad de estos dos sitios de nucleación de MTs varía a lo largo del ciclo celular sugiriendo la existencia de algún tipo de regulación coordinada de sus respectivas actividades. AKAP450, CDK5Rap2 y pericentrina (PCNT) son tres de las principales proteínas descritas como posibles reguladoras de dicho mecanismo de nucleación y presentes en ambos orgánulos. Así, en esta tesis, hemos llevado a cabo un análisis de los mecanismos implicados en el control del comportamiento coordinado de los diferentes MTOCs celulares combinando la eliminación de estos tres principales factores reclutadores de complejos γTuRC (AKAP450, CDKRap2 y PCNT) y el uso del recientemente descubierto inhibidor de PLK4 (proteína esencial en la duplicación del centrosoma) centrinona. Los resultados presentados demuestran que las proteínas implicadas tradicionalmente en el reclutamiento de complejos γTuRC no son esenciales para la nucleación de MTs desde el centrosoma en interfase; mientras que sí van a controlar esta función en el AG. Varias líneas argumentales apoyan esta conclusión. Primera, la inhibición de la expresión de AKAP450, CDK5Rap2 y PCNT en células hTERTRPE1 no afecta a los niveles de nucleación desde el centrosoma ni al reclutamiento de γ-tubulina. Centrosomas carentes de las tres proteínas son capaces de nuclear MTs a ratios normales gracias a la función de CEP192; quién sí parece ejercer una contribución importante pero no esencial en este mecanismo. Segunda, células carentes de estas cuatro proteínas aún presentaban cierta capacidad de nucleación de MTs desde el centrosoma, lo que demuestra la existencia de mecanismos adicionales a los generalmente considerados cómo canónicos. Tercero, en el caso del AG, es ya conocido que su capacidad para nuclear MTs depende de la presencia de AKAP450 (Rivero et al. 2009), y nuestros resultados demuestran que tanto CDK5Rap2 como pericentrina también influyen en estos niveles. Así, células carentes de CDK5Rap2 presentaban una menor capacidad de nucleación desde el AG mientras que en el caso de la ausencia de pericentrina, esta actividad se veía claramente potenciada; lo que indica el papel inhibitorio de la proteína. Ensayos de coinmunoprecipitación revelaron la existencia de dos tipos de complejos capaces de reclutar γTuRCs; aquellos basados en AKAP450 y los basados en pericentrina. Ambos desempeñan funciones antagónicas en los mecanismos de nucleación desde el AG y son totalmente dispensables en el papel del centrosoma como MTOC

Dual Role of the centrosome in MT network organization during interphase

Trabajo presentado en el Consolider-COAT-Annual Meeting, celebrado en Madrid los días 7 y 8 de marzo de 2018Peer reviewe

The yeast Ptc7p mitochondrial phosphatase, the crossroad of coenzyme Q biosynthesis, mitophagy activation and chronological life span extension

Resumen del póster presentado al 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress, celebrado en Sevilla (España) del 4 al 9 de septiembre de 2012.-- et al.Coenzyme Q (CoQ or Q) is an essential isoprenylated benzoquinone component of mitochondria, which functions mainly as an electron carrier from complex I, or II to complex III at the inner membrane, and as an antioxidant particularly on lipoproteins and plasma membrane. CoQ biosynthesis is a highly regulated process driven by a multi-protein complex that catalyzes the modifications of the benzene ring. Coq7p/Cat5p (Coq7p) catalyzes one of the latest steps required for the final conversion of the late intermediate demethoxy-Q6 (DMQ6) to Q6, which also represents a key regulatory step in this pathway. Coq7p dephosphorylation was produced by the mitochondrial Ptc7 protein Ser/Thr phosphatase that activates aerobic yeast metabolism by regulating coenzyme Q (CoQ) biosynthesis. Yeast lacking PTC7 (YHR076w) gene exhibited decreased of both mitochondrial function and oxidative stress defenses, leading to increased protein carbonylation damage. CoQ content was decreased in PTC7 deleted strain, suggesting that during respiratory metabolism Ptc7p activates the CoQ6 biosynthesis. Ptc7p dephosphorylates Coq7p in both in vivo and in vitro assays. PTC7 null mutant exhibited increased Coq7p phosphorylation when CoQ biosynthesis was induced. Chronological life span (CLS) is defined as a survival mechanism that depends on metabolic and stress adaptations to environment. PTC7 strain showed a decreased CLS that was not rescued by exogenous CoQ6. Rescue of CLS required Ptc7p that also activated mitophagy but not macroautophagy. These results led us to propose that Ptc7p links homeostasis of CoQ by regulating its biosynthesis through the phosphorylation stage of Coq7p and mitochondrial recycling as an adaptation mechanism to both stress and nutritional environment changes to promote CLS.Peer reviewe

Regulation of coenzyme Q biosynthesis in yeast: A new complex in the block

Coenzyme Q (CoQ) is an isoprenylated benzoquinone found in mitochondria, which functions mainly as an electron carrier from complex I or II to complex III in the inner membrane. CoQ is also an antioxidant that specifically prevents the oxidation of lipoproteins and the plasma membrane. Most of the information about the synthesis of CoQ comes from studies performed in Saccharomyces cerevisiae. CoQ biosynthesis is a highly regulated process of sequential modifications of the benzene ring. There are three pieces of evidence supporting the involvement of a multienzymatic complex in yeast CoQ6 biosynthesis: (a) the accumulation of a unique early precursor in all null mutants of the COQ genes series, 4-hydroxy-3-hexaprenyl benzoate (HHB), (b) the lack of expression of several Coq proteins in COQ null mutants, and (c) the restoration of CoQ biosynthesis complex after COQ8 overexpression. The model we propose based on the formation of a multiprotein complex should facilitate a better understanding of CoQ biosynthesis. According to this model, the complex assembly requires the synthesis of a precursor such as HHB by Coq2p that must be recognized by the regulatory protein Coq4p to act as the core component of the complex. The phosphorylation of Coq3p and Coq5p by the kinase Coq8p facilitates the formation of an initial precomplex of 700 kDa that contains all Coq proteins with the exception of Coq7p. The precomplex is required for the synthesis of 5-demethoxy-Q6, the substrate of Coq7p. When cells require de novo CoQ6 synthesis, Coq7p is dephosphorylated by Ptc7p, a mitochondrial phosphatase that activates the synthesis of CoQ6. This event allows for the full assembly of a complex of 1,300 kDa that is responsible for the final product of the pathway, CoQ6.The work was supported by the Spanish Ministerio de Ciencia y Tecnología, Spanish PI11/00078, Junta de Andalucía P08-CTS-03988, and by the International Q10 Association “Phosphorylation based regulation of coenzyme Q biosynthesis in yeast.” A.M.M. received a predoctoral fellowship from the Consejería de Innovación Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía (Spain). I.G.M. received a predoctoral fellowship from the Plan Propio of the Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. T.P.V. and P.G.D. received a predoctoral fellowship from the CIBERER-ISCIII (Spain).Peer Reviewe

The regulation of coenzyme Q biosynthesis in eukaryotic cells: All that yeast can tell us

Coenzyme Q (CoQ) is a mitochondrial lipid, which functions mainly as an electron carrier from complex I or II to complex III at the mitochondrial inner membrane, and also as antioxidant in cell membranes. CoQ is needed as electron acceptor in β-oxidation of fatty acids and pyridine nucleotide biosynthesis, and it is responsible for opening the mitochondrial permeability transition pore. The yeast model has been very useful to analyze the synthesis of CoQ, and therefore, most of the knowledge about its regulation was obtained from the Saccharomyces cerevisiae model. CoQ biosynthesis is regulated to support 2 processes: the bioenergetic metabolism and the antioxidant defense. Alterations of the carbon source in yeast, or in nutrient availability in yeasts or mammalian cells, upregulate genes encoding proteins involved in CoQ synthesis. Oxidative stress, generated by chemical or physical agents or by serum deprivation, modifies specifically the expression of some COQ genes by means of stress transcription factors such as Msn2/4p, Yap1p or Hsf1p. In general, the induction of COQ gene expression produced by metabolic changes or stress is modulated downstream by other regulatory mechanisms such as the protein import to mitochondria, the assembly of a multi-enzymatic complex composed by Coq proteins and also the existence of a phosphorylation cycle that regulates the last steps of CoQ biosynthesis. The CoQ biosynthetic complex assembly starts with the production of a nucleating lipid such as HHB by the action of the Coq2 protein. Then, the Coq4 protein recognizes the precursor HHB acting as the nucleus of the complex. The activity of Coq8p, probably as kinase, allows the formation of an initial pre-complex containing all Coq proteins with the exception of Coq7p. This pre-complex leads to the synthesis of 5-demethoxy-Q6 (DMQ6), the Coq7p substrate. When de novo CoQ biosynthesis is required, Coq7p becomes dephosphorylated by the action of Ptc7p increasing the synthesis rate of CoQ6. This critical model is needed for a better understanding of CoQ biosynthesis. Taking into account that patients with CoQ10 deficiency maintain to some extent the machinery to synthesize CoQ, new promising strategies for the treatment of CoQ 10 deficiency will require a better understanding of the regulation of CoQ biosynthesis in the future.The work was supported by the Spanish Ministerio de Ciencia y Tecnología, Spanish PI11/00078, Junta de Andalucía P08-CTS-03988 and by the International Q10 Association ‘Phosphorylation based regulation of coenzyme Q biosynthesis in yeast’. A.M.-M. received a predoctoral fellowship from the Consejería de Innovación Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía (Spain). I.G.-M. received a predoctoral fellowship from the Plan Propio of the Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. T.P.V. and P.G.D. received a predoctoral fellowship from the CIBERER-ISCIII (Spain).Peer Reviewe