HLA Ligand Atlas: a benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy

BACKGROUND The human leucocyte antigen (HLA) complex controls adaptive immunity by presenting defined fractions of the intracellular and extracellular protein content to immune cells. Understanding the benign HLA ligand repertoire is a prerequisite to define safe T-cell-based immunotherapies against cancer. Due to the poor availability of benign tissues, if available, normal tissue adjacent to the tumor has been used as a benign surrogate when defining tumor-associated antigens. However, this comparison has proven to be insufficient and even resulted in lethal outcomes. In order to match the tumor immunopeptidome with an equivalent counterpart, we created the HLA Ligand Atlas, the first extensive collection of paired HLA-I and HLA-II immunopeptidomes from 227 benign human tissue samples. This dataset facilitates a balanced comparison between tumor and benign tissues on HLA ligand level. METHODS Human tissue samples were obtained from 16 subjects at autopsy, five thymus samples and two ovary samples originating from living donors. HLA ligands were isolated via immunoaffinity purification and analyzed in over 1200 liquid chromatography mass spectrometry runs. Experimentally and computationally reproducible protocols were employed for data acquisition and processing. RESULTS The initial release covers 51 HLA-I and 86 HLA-II allotypes presenting 90,428 HLA-I- and 142,625 HLA-II ligands. The HLA allotypes are representative for the world population. We observe that immunopeptidomes differ considerably between tissues and individuals on source protein and HLA-ligand level. Moreover, we discover 1407 HLA-I ligands from non-canonical genomic regions. Such peptides were previously described in tumors, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), healthy lung tissues and cell lines. In a case study in glioblastoma, we show that potential on-target off-tumor adverse events in immunotherapy can be avoided by comparing tumor immunopeptidomes to the provided multi-tissue reference. CONCLUSION Given that T-cell-based immunotherapies, such as CAR-T cells, affinity-enhanced T cell transfer, cancer vaccines and immune checkpoint inhibition, have significant side effects, the HLA Ligand Atlas is the first step toward defining tumor-associated targets with an improved safety profile. The resource provides insights into basic and applied immune-associated questions in the context of cancer immunotherapy, infection, transplantation, allergy and autoimmunity. It is publicly available and can be browsed in an easy-to-use web interface at https://hla-ligand-atlas.org

The immunopeptidomic landscape of intracranial neoplasias – Target identification for immunotherapy of glioblastoma, medulloblastoma, and meningioma

Jedes Jahr werden in den Vereinigten Staaten mehr als 80.000 neue Fälle intrakranieller Neoplasien, welche die achthäufigste Tumorart bei Erwachsenen über 40 Jahren und sogar die häufigste Tumorerkrankung im Kindesalter sind, diagnostiziert. Dazu zählen Neubildungen des Hirnparenchyms wie Glioblastome oder Medulloblastome und Tumore der Hirnhäute. Während der letzten Jahrzehnte blieb die Prognose intrakranieller Neoplasien schlecht, was intensive Forschung zur Etablierung neuer Therapien unabdingbar macht. Besonders für rekurrente und nicht resezierbare Tumore gibt es keine evidenzbasierte Behandlung, wohingegen die Bestrahlung des kindlichen sich entwickelnden Gehirns schwere Langzeitschäden verursacht. Die Entwicklung und erfolgreiche Anwendung von Immuncheckpoint-Antikörpern hat eine neue Ära multi-modaler Tumortherapien eingeläutet. Patienten mit intrakraniellen Neoplasien haben von den jüngsten Fortschritten klinisch gesehen jedoch nicht profitiert. Besonders das Ansprechen auf Immuncheckpoint-Inhibitoren korreliert positiv mit der Mutationslast, welche in Hirntumoren niedrig ist. Das erklärt unter anderem auch, weshalb es bislang nicht möglich war, die HLA-Präsentation von Neo-Antigenen auf Hirntumorzellen nachzuweisen. In einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie rief die Anwendung eines Multi-Peptidimpfstoffs, der sich gegen nicht-mutierte HLA-Liganden richtet, beachtliche Immunantworten in Patienten mit primärem Glioblastom hervor. Obwohl wir den Nachweis für die ersten beiden mutierten HLA-Liganden im Glioblastom erbringen konnten, sind wir davon überzeugt, dass nicht-mutierte Antigene peptid-spezifische immuntherapeutische Ansätze für intrakraniellen Neoplasien mit geringer Mutationslast prägen werden. Um mögliche Zielantigene für Immuntherapien zu bestimmen, wurde eine groß angelegte Untersuchung des HLA Klasse I- und II-Peptidoms in Glioblastomen (N=62), Medulloblastomen (N=28) und Meningeomen (N=33) durchgeführt. Wir haben eine neuartige Zusammenstellung von Antigenen und Peptiden definiert, welche sich durch natürliche, häufige und tumor-exklusive HLA-Präsentation auf nativem humanem Tumorgewebe auszeichnen – etablierte tumor-assoziierte und Cancer-Testis (“Tumor-Hoden”) Antigene erfüllten diese Kriterien dagegen nicht. Die Bestimmung von Tumor-Exklusivität erfolgte durch den Abgleich mit einem Referenzdatensatz, welcher Immunpeptidome von circa 400 benignen humanen Geweben aus 30 verschiedenen Organen beinhaltet. Bei Glioblastomen wurden zudem primäre und rekurrente Tumore verglichen, was nicht nur Dynamiken der Antigenpräsentation im Laufe des Fortschreitens der Erkrankung aufdeckte, sondern bot auch die Möglichkeit, eine Beschränkung auf jene möglichen Zielantigene vorzunehmen, welche in beiden Krankheitsstadien robust präsentiert sind. Die Implementierung einer Mischung aus zehn isotopen-markierten synthetischen Peptiden als Retentionszeitstandard wird zukünftige Studien des Immunpeptidoms leiten, was innovative massenspektrometrische Datenaufzeichnungsstrategien und quantitative Ansätze mit verbesserten Identifikations- und Reproduzierbarkeitsraten unterstützen wird. Zusammenfassend haben wir das Immunpeptidom des Glioblastoms, des Medulloblastoms sowie des Meningeoms in einer beispiellosen Tiefe untersucht, was die Zusammenstellung einer umfangreichen und neuartigen Liste tumor-assoziierter Antigene und Peptide ermöglichte. Da diese natürlich, häufig und tumor-exklusiv auf HLA Klasse I- oder II-Molekülen präsentiert sind, stellen diese erstklassige Kandidaten dar, um intrakranielle Neoplasien durch antigen-spezifische Immuntherapien vermittelt durch T-Zellen anzugreifen. Das könnte dazu beitragen, der dringenden Forderung nach Alternativen zur Strahlentherapie bei der Behandlung kindlicher Hirntumoren sowie nach Leitlinien für die Behandlung nicht resezierbarer und rekurrenter Neoplasien nachzukommen.Intracranial neoplasias account for more than 80,000 new cases in the US every year representing the eighth most common tumors in adults older than 40 years and even the most frequent pediatric tumor entity. They comprise malignancies of the brain parenchyma such as glioblastoma or medulloblastoma as well as meningeal neoplasms. Throughout the last decades, the outcome of intracranial neoplasias has remained poor calling for intensive research to establish novel therapies. Especially recurrent and non-resectable tumors are characterized by a profound lack of evidence-based therapeutic options, while irradiation of the developing brain in children causes severe long-term sequelae. With the development and successful administration of checkpoint antibodies, a new era of multimodal anti-tumor therapies has dawned. Patients suffering from intracranial neoplasias have, however, not clinically benefited from the recent advancements. The response to checkpoint blockade, in particular, positively correlates with mutational burden, which is low in brain tumors. This also reasons why neo-antigens have not yet been confirmed to be presented on HLA molecules of brain tumor cells. In a recent clinical trial, the administration of a multi-peptide vaccine targeting non-mutated HLA ligands has elicited remarkable immune responses in primary glioblastoma. Although we succeeded in proving the first two neo-antigenic HLA ligands in glioblastoma, we are convinced that non-mutated antigens will coin peptide-specific immunotherapeutic efforts for intracranial neoplasias with low mutational burden. To define candidate targets for cancer immunotherapy, a large-scale study of the HLA class I and II peptidomes of glioblastoma (n=62), medulloblastoma (n=28), and meningioma (n=33) was performed. We defined a novel set of antigens and peptides characterized by natural, frequent, and tumor-exclusive HLA presentation on native human tumor tissue, whereby established tumor-associated and cancer-testis antigens did not fulfill these criteria. Tumor exclusivity was assessed by comparison with a reference immunopeptidome dataset acquired from approximately 400 benign human tissues covering 30 different organs. For glioblastoma, an additional comparison of primary and recurrent tumors was performed delineating not only dynamics of antigen presentation during disease progression, but also enabling further restriction of candidate targets to those robustly presented at both disease conditions. The implementation of a mix of ten synthetic heavy isotope-labeled peptides as retention time standard will guide future immunopeptidomic studies fostering innovative mass spectrometric data acquisition strategies and quantitative approaches with enhanced identification and reproducibility rates. In conclusion, we investigated the immunopeptidomic landscape of glioblastoma, medulloblastoma, and meningioma in an unprecedented depth unveiling a large novel set of entity-specific tumor-associated antigens and peptides. Being naturally, frequently, and tumor-exclusively presented on HLA class I or II molecules, these represent prime candidates to deliver the power of T cells via antigen-specific immunotherapies to intracranial neoplasias. This may contribute to meet the urgent demand for alternatives to radiotherapy in the treatment of pediatric brain tumors as well as for therapeutic regimens to manage non-resectable neoplasms and disease recurrence