Ciliaten (Protozoa, Ciliophora) des Reisfeldbodens

Reisfeldböden sind die Bodenökosysteme, die während der letzten Dekade am intensivsten studiert wurden. Dabei haben sich Reisfeldböden in den letzten Jahren als geeignetes Modellökosystem zur Untersuchung von mikrobiellen Populationen und biogeochemischen Prozessen im Boden bewährt. Der Einfluß anderer wichtiger Bodenorganismen, wie der Protozoen, wurde bisher nicht studiert. Um den Einfluß dieser Organismen auf die mikrobielle Gemeinschaft (Bakteria und Archaea) und Biogeochemie von anoxischen Reisfeldböden abschätzen zu können, wurde stellvertretend das Taxon Ciliophora Doflein, 1904 als repräsentative und häufige Gruppe der Protozoa untersucht. In dem untersuchten italienischen Reisfeldboden wurden insgesamt 52 Taxa gefunden. Zusätzlich wurde Reisfeldboden anoxisch mit Wasser gesättigt (aber nicht geflutet), für ca. 160 Tage inkubiert. In diesen anoxischen Inkubationen wurden 23 Taxa entdeckt, wovon bisher nur 7 als obligat anaerob bekannt waren. Die anderen 16 Taxa sind als fakultativ anaerobe Taxa anzusehen. Dies zeigte, daß die Toleranz gegen anoxische Verhältnisse unter den Ciliaten des Bodens weiter verbreitet ist als bisher angenommen. Die Zellzahlen in den anoxischen Inkubationen lagen zwischen 34 und 190 Zellen gTG-1 Boden. Bezogen auf Zellzahlen und Biovolumenanteil dominierten in den anoxischen Inkubationen kontinuierlich Arten der obligat anaeroben Gattung Metopus. Weiterhin wurde der Einfluß der Ciliatenfauna auf die mikrobielle Gemeinschaft untersucht. Dabei unterschieden sich die Verteilungen der mikrobiellen Biovolumina an zwei Meßzeitpunkten (Tag 4 und Tag 80) deutlich voneinander. An Tag 4 wurden auch größte und kleinste Zellvolumina (Volumen von 0,25 – 2,25 µm3) gefunden. Eine solche Verteilung der Zellgrößen ist typisch für durch Protozoen beweidete Mikroorganismen. Nach 80 Tagen wurden nur mittlere Volumina gefunden (Volumen von 0,75 – 1,5 µm3). Bestätigt wird dieses Ergebnis durch einen in den ersten 4 Tagen beobachteten negativen Quotient der mikrobiellen und der Ciliatenvolumina. Mit Fluoreszenz in-situ Hybridisierung wurde eine bevorzugte Ingestion von Bakteria nachgewiesen. In einigen Fällen wurden jedoch auch Archaea in den Nahrungsvakuolen detektiert. Zusätzlich zu methanogenen Endosymbionten wurde in einigen Arten der Gattung Metopus ein weiterer den ?–Proteobacteria zugeordneter Endobiont identifiziert. Nähere Informationen zur Physiologie des Endobionten wurden bisher nicht gefunden. Die Bildung von Methan wurde in anoxischen Inkubationen bereits nach 24 h gemessen. Einige Details der frühen Methanogenese sind zur Zeit noch unklar. Eine mögliche Erklärung für die frühe Methanogenese sind methanogene Endosymbionten, wie sie in Ciliaten der Gattung Metopus gefunden wurden. Anhand von eigenen Zellzahlbestimmungen und Werten aus der Literatur (Fenchel T. und Finlay B.J. 1995: Ecology and evolution in anoxic worlds. Oxford University Press) wurden zwei Modelle zur potentiellen CH4-Produktion der methanogenen Endosymbionten berechnet. Diese Modelle erklärten 2 bzw. 59% des in den ersten zwei Wochen gebildeten CH4. Das erste Modell (2%) berücksichtigte am detailliertesten das untersuchte Habitat und wurde demnach bevorzugt. Eine Hemmung von Eukaryonten mit spezifischen Inhibitoren bewirkte in anoxischen Inkubationen eine deutliche Erhöhung der CH4-Produktion. Die Summe des zusätzlich gebildeten CH4 war weder über den vom Inhibitor eingebrachten Kohlenstoff noch über einen Abbau lysierter Ciliatenbiomasse zu erklären. Es wurde daher eine -durch Beweidung von Ciliaten induzierte- Unterdrückung der aktiven, freilebenden Methanogenen postuliert. Anhand der in dieser Arbeit gewonnenen Daten wurde gezeigt, daß Protozoen auch in Inkubationen anoxischen Reisfeldbodens einen deutlichen, aber zeitlich begrenzten Einfluß auf die mikrobielle Gemeinschaft und die Methanogenese haben. Berücksichtigt man, daß die Ciliaten nur eine der vier häufigsten Protozoengruppen darstellen, lassen diese Ergebnisse einen noch deutlicheren Einfluß der gesamten Protozoenfauna erwarten. Um die relative Abundanz und Diversität der gesamten Protozoenfauna abschätzen zu können, soll in einem kommenden Projekt eine molekulare Charakterisierung der Gemeinschaft auf Basis der 18S rDNS erfolgen

Novel deep branching Cu-containing membrane-bound monooxygenases: distribution and function

The key enzyme of the aerobic methane oxidation is the particulate methane monooxygenase (pMMO) pMMOs are members of the great family of Cu-containing membrane-bound monooxygenases (CuMMO). Genes of the pMMO operon can occur in multiple copies within the genome of methanotrophic bacteria. Some of them encode pMMO isoenzymes with alternative functions. A new isoenzyme (pXMO) has been recently found in some alpha- and gamma-proteobacterial methanotrophs. pxmA sequences of this isoenzyme do not cluster within groups of characterized pmoA sequences but within the environmental group (M84_P105) that belongs to the distantly related intermediate CuMMO (iCuMMO). To analyze the distribution of pxmA sequences in methanotrophic pure cultures and nature primers were designed that target several iCuMMO groups (including M84_P105). The pxmA could be detected in several strains of the methylotrophic genera Methylomonas, Methylobacter and Methylosarcina. Additionally, it could be shown that pxmA sequences are widespread and numerous in different environment. Almost all iCuMMO groups are not represented by pure cultures. Hence, little sequence information is available which makes the study of the iCuMMOs difficult. A magnetic capture hybridization method (MCH) was established to gain more sequence information of the iCuMMOs. MCH avoids the use of specific primers and may provide long target sequences and information about operon structures of the iCuMMOs. The physiological functions of the iCuMMOs are unknown. Due to a phylogenetic relationship of pxmA sequences to sequences of alkane oxidizers we suggested that they might be involved in alkane degradation, too. However, incubation experiments of pure cultures and environmental indicate that the analyzed iCuMMOs are not involved in alkane degradation. Pure culture incubations indicate that the pxmA of the environmental group M84_P105 might be involved in methane oxidation. But further studies need to be performed to confirm this hypothesis. The physiological function of the other iCuMMO groups remains still unknown. iCuMMOs were underestimated for a long time but this study shows that are widely distributed and may play an important role global element cycles. Methanotrophic bacteria has been believed to be obligate but facultative methanotrophs has been found among the type II methanotrophs that grow on substrates with carbon-carbon bounds like acetate, pyruvate, succinate, malate and ethanol. In this study we could show that type II methanotrophs play a role in the degradation of short chained alkanes in rice field soils. If they use the alkanes directly or if they use metabolic products provided by other bacteria needs to be analyzed. But these findings show that the restricted role of the methanotrophs to certain substrates and specific functions needs to be expended

Terminale Prozesse des anaeroben Abbaus in sauren Torfmooren der Subarktis und des südlichen Boreals

Moorgebiete spielen als CO2-Senken und CH4-Quellen eine herausragende Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf. Insbesondere die Moore der nördlichen Hemisphäre sind bedeutende Reservoire für im Boden gebundenen organischen Kohlenstoff. Eine bereits voranschreitende globale Erwärmung macht diese Kohlenstoffreservoire mikrobiell verfügbar und kann zu einer Erhöhung der CH4- und CO2-Emissionen führen. Während Physiologie und Thermodynamik der Methanogenese sehr gut untersucht worden sind, besteht noch erheblicher Forschungsbedarf hinsichtlich Struktur und Funktion methanogener Gemeinschaften. Insbesondere die regulierenden Faktoren in sauren Mooren sind weitgehend unerforscht. Hier wurden zentrale Fragen zur Charakterisierung der methanogenen Gemeinschaften und der mit der Methanogenese gekoppelten Prozesse in sauren Torfmooren (N-Finnland, W-Sibirien und Estland) bearbeitet. Im ersten Teil wurde erstmals die Bedeutung von endogenem Ethanol als Substrat für die Methanogenese und die Fe(III)-Reduktion in einem subarktischen Moor in N-Finnland gezeigt. Der Kohlenstoffbilanz zufolge gingen 50% des Ethanols über syntrophe Oxidation in die Methanogenese und 50% in die Fe(III)-Reduktion ein. 80% des gebildeten CH4 stammten aus H2/CO2. Entsprechend ergab die phylogenetische Analyse des 16S rRNA-Gens und des Gens für die α-Untereinheit der Methyl-CoenzymM-Reduktase, dass mutmaßlich ein einziges Mitglied der Familie Methanobactericeae für die Methanogenese verantwortlich war. Hohe CH4-Bildungsraten auch bei 4°C deuteten auf die Präsenz einer psychrophilen Gemeinschaft hin. Während die Analyse der T-RFLP-Muster eine stabile Zusammensetzung der archaeellen Gemeinschaft über den gesamten Temperaturgradienten hinweg ergab, zeigte die Real-Time-PCR ein temperaturabhängiges Wachstum sowohl der bakteriellen als auch der archaeellen Gemeinschaft. Sowohl Substratumsatz als auch das Wachstum der mikrobiellen Gemeinschaft waren stark temperaturabhängig und eng gekoppelt. Auch in dem untersuchten sibirischen Moor waren syntrophe Prozesse Hauptlieferanten für methanogene Vorstufen. >70% des gebildeten CH4 stammten hier aus der acetoclastischen Methanogenese. Aufgrund des stöchiometrischen Verhältnisses der aus der syntrophen Butyratoxidation stammenden Produkte H2 und Acetat wird dieser Prozess hier als Hauptlieferant für die methanogenen Substrate angesehen. Die phylogenetische Analyse des Gens für die 16S rRNA zeigte, dass Mitglieder der Familien Methanosarcinaceae und der Methanobacteriaceae für die Methanogenese verantwortlich waren. Alle Prozesse waren stark temperaturabhängig. Es gibt einige Hinweise dafür, dass die Methanogenese nicht direkt durch die Temperatur stimuliert wurde, sondern indirekt durch die Substrat liefernden syntrophen Prozesse. Erstmalig für ein saures Hochmoor (Estland) wurde mit Hilfe von [2-13C/14C]-Acetat-Markierungsexperimenten die syntrophe Oxidation von Acetat gezeigt. Dieser Prozess ist bisher nur in Bioreaktoren und Seesedimente experimentell nachgewiesen worden. Die phylogenetische Analyse zeigte eine sehr diverse, jedoch von hydrogenotrophen Methanogenen dominierte Gemeinschaft. Markierungsexperimente mit 14C-Bicarbonat wiesen auf die Anwesenheit von Homoacetogenen hin, deren Aktivität durch die Inkubation mit H2 stimuliert wurde. Die phylogenetische Analyse des Gens für die Formyltetrahydrofolat-Synthetase, eines Schlüsselenzyms des Acetyl-CoA-Wegs, unterstützte die Anwesenheit von Homoacetogenen. Da die bisher bekannten syntrophen Acetatoxidierer Homoacetogene sind, die Acetat über den reversen Acetyl-CoA-Weg oxidieren, könnten auch hier Homoacetogene für die syntrophe Acetatoxidation verantwortlich gewesen sein. Trotz der Abwesenheit alternativer Elektronenakzeptoren wie Fe(III) im estnischen Hochmoor wurden mit 16S rRNA-Gen spezifischen Primern Mitglieder der Familie Geobacteraceae detektiert. Diese Mikroorganismen spielen eine wichtige Rolle bei der Fe(III)-Reduktion in Fe(III)-reichen Habitaten. Wie die Zugabe von Ferrihydrit beziehungsweise FeCl3 zeigte, spielte Fe(III)-Reduktion jedoch eine untergeordnete Rolle: Nur 4-6% des vorhandenen Fe(III) wurden zu Fe(II) reduziert. Mitglieder der Familie Geobacteraceae sind also nicht zwingend an der Fe(III)-Reduktion beteiligt und scheinen ein breiteres Spektrum an ökologischen Nischen einzunehmen als bisher angenommen. Zusammenfassend lassen die hier präsentierten Ergebnisse den Schluss zu, dass syntrophe Prozesse von genereller Bedeutung in Mooren der nördlichen Hemisphäre sein könnten. Wegen der anoxischen Bedingungen in Mooren ist der mikrobielle Abbau stark gebremst, sodass die Mikroorganismen dauerhaft Substrat limitierenden Bedingungen ausgesetzt sind und am thermodynamischen Limit agieren. Aus diesem Grund mag das Überleben der Mikroorganismen von den aus thermodynamischer Sicht ungünstigen syntrophen Prozessen abhängen

Ökologie methanotropher Bakterien: Räumliche Verteilung und Funktion methanotropher Bakterien in Feuchtgebieten.

Methan ist neben CO2 das wichtigste Treibhausgas, dessen relatives Treibhauspotential ungefähr ein drittel höher liegt als das von CO2. Der Großteil atmosphärischen Methans wird dabei aus biogenen Methanquellen freigesetzt, zum Beispiel renaturierte Mülldeponien, Feuchtgebiete oder Reisfelder. Methanotrophe Bakterien (MOB) können die Methanemission hier um bis zu 80 % reduzieren. Infolgedessen ist ihre Physiologie, Diversität und Ökologie in zahlreichen Studien untersucht worden. Es fehlen jedoch grundlegende Studien über die räumliche Verteilung von MOB in ihrer Umwelt. Des Weiteren sind die Populationsdynamiken von MOB und die Beteiligung spezifischer Taxa an der Methanoxidation bisher wenig verstanden. Zudem beginnt man erst jetzt zu erkennen, dass Umweltstörungen einen signifikanten Effekt auf die Stabilität und Funktion mikrobieller Lebensgemeinschaften haben. Die Zusammenhänge von Diversität und Funktion und die Regulation der MOB durch natürliche und/oder anthropogene Umweltfaktoren sind bisher jedoch kaum untersucht worden. In dieser Arbeit wurde das pmoA Gen als phylogenetischer und funktioneller Marker verwendet, um MOB in Umweltproben zu detektieren. Während es speziell an das Reisfeld adaptierte pmoA Genotypen zu geben scheint, können sich methanotrophe Lebensgemeinschaften in Reisfeldern derselben Region deutlich unterscheiden. Der Einfluss von Umweltgradienten variiert in Agrar- und natürlichen Ökosystemen und muss bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden. Am Beispiel von Reisfeldern konnte gezeigt werden, dass MOB keine großskalige räumliche Strukturierung aufwiesen und sowohl eine systematische als auch eine Zufallsprobennahme repräsentativ ist. Zudem konnten Populationdynamiken nach der Flutung eines Reisfeldes nachgewiesen werden, obwohl die Methanoxidationrate konstant blieb. Eine artenreiche mikrobielle „seed bank“ scheint für die Erhaltung der Funktion in solchen dynamischen Ökosystemen eine große Rolle zu spielen. Betrachtet man sich die methanotrophe Lebensgemeinschaft unter verschieden Energieflüssen und dem Effekt von Stickstoffdüngung, so hat die Düngung keinen Effekt auf die methanotrophen Lebensgemeinschaften. Es werden jedoch unter verschiedenen Energieflüssen aus der „seed bank“ unterschiedliche MOB aktiviert. Es scheint, dass Arten der Gattung Methylobacter und Arten deren pmoA Sequenzen zu einem Cluster mit Umweltsequenzen aus Reisfeldern gehören, speziell an Habitate mit hoher Methankonzentration adaptiert sind. MOB scheinen sehr widerstandsfähig zu sein und Änderungen in Energieflüssen scheinen einen größeren Effekt auf die methanotrophe Lebensgemeinschaft zu haben

Methane oxidizing bacteria at the oxic-anoxic interface : taxon-specific activity and resilience

The methanotrophic bacteria are the only known biological sink for the third most important greenhouse gas methane, performing an important ecosystem function influencing global climate change. In the soil surface layer of water logged soils aerobic methanotrophs thrive at the oxic-anoxic interface attenuating the amount of potentially emitted methane. The highly diverse methanotroph community is shaping the interface characterized by overlapping methane and oxygen gradients by their own activity. However, how the different methanotrophs physically share their microhabitat at the interface is unknown. Here we highly resolved the vertical distribution and activity of methanotrophs at the interface. To assess the structure of the present and active methanotroph community the particulate methane monooxygenase gene pmoA was used as a functional and phylogenetic marker. For quantification of pmoA genes and transcripts a new method, the competitive-(reverse transcriptase)-t-RFLP was established. Only a subset of the methanotroph community was shown to be active and the major activity was confined to a small zone around the interface. The predominantly active methanotrophs were affiliated to Methylobacter and no transcripts of type II methanotrophs (Methylosinus, Methylocystis) were found. Hence, different species within this guild exploited different niches in the same microenvironment. Furthermore, the methanotrophs resistance to desciccation (up to 18 years) was tested. Longer-lasting droughts reduced methanotrophic diversity, and adversely affected methane oxidation upon rewetting. Type I methanotrophs showed relatively higher pmoA gene expression, while type II were more resistant to desiccation. Finally, we showed that high methane source strength aids the ability of the methanotroph community to recover from the effect of a strong disturbance. However, recovery of the type II community was independent of pmoA gene expression and source strength indicating facultative growth. Overall, the methanotroph community in the soil surface layer is highly diverse. This work contributed to understand the high and apparently redundant diversity by unravelling niche differentiation at the fine spatial resolution and evaluating the effect of different source strength. Moreover, the range of alternative substrates used for growth seems to be another important factor in the environment

Response and resilience of methanotrophs to disturbances

Methanotrophic bacteria are the only known biological sink for the greenhouse gas methane. Therefore, methanotrophs play a key function in carbon cycling, an important biogeochemical process that affects global climate change. Yet, little is known of their vulnerability and resilience to disturbances. Driven by the gap of knowledge, this PhD thesis is a seminal study focusing on the recovery of methanotrophs from disturbances with respect to population dynamics, diversity and functioning. Two model disturbances were tested; disturbance-induced mortality and heat shock. While the former model disturbance represents a non-selective form of disturbance, the heat shock treatment may select for sub-populations of thermo-tolerant methanotrophs. Overall, methanotrophs are shown to be remarkably resilient to induced disturbances, compensating and even over-compensating for methane uptake during recovery. Type II methanotrophs, known to be present in high abundance as resting cells, appear to become more important during disturbances. Furthermore, the establishment and subsequent development of the methanotrophic community and activity were studied along a rice paddy chronosequence. With the influx of anthropogenic influences once a rice paddy is formed, the methanotrophic community structure is anticipated to undergo a dramatic change which in turn, may affect the activity. It appears that the young and ancient rice paddies do not show clear divergence, suggesting that the methane oxidizing community was soon established after a rice paddy is formed. However, the selection of the best adapted sub-population needs time. Accordingly, long term rice agriculture allows for higher methane uptake, and may select for a methanotroph sub-population that remains active. The predominant methanotrophs found in the Chinese rice paddies are type II, mainly Methylocystis species, and type Ib (RPC-1). However, type Ib seems to be the active dominant sub-population. This and previous studies suggest specific adaptation of type Ib to rice paddy environments. Interestingly, novel sequences phylogenetically grouped between pmoA and amoA were detected. Overall, paddy soil methanotrophs are not only able to recover from disturbances, but are apparently showing specific adaptation to rice paddy environments, demonstrating their resilience in face of perturbation