Biomarcadores de contaminação em peixes de água doce, por exposição ao chumbo (II) : ensaios laboratoriais com Hoplias malabaricus e Oreochromis niloticus

Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira RibeiroCoorientadora: Prof.ª Dr.ª Helena Cristina da Silva de AssisDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia CelularInclui referências: p. 123-129Resumo: No presente trabalho duas espécies de peixes de água doce, Hoplias malabaricus (traíra) e Oreochromis niloticus (tilápia), foram expostas a condições experimentais para o estudo dos efeitos tóxicos do Chumbo (II), após as exposições trófica (crônica) e hídrica (aguda), respectivamente. A exposição trófica e crônica de H. malabaricus ao Chumbo (II) foi realizada com a dose nominal ingerida de 21 µg Pb ++.g-1 a cada 120h e as amostras de material biológico foram coletadas após 4 doses (18 dias) e 8 doses (41 dias). Os efeitos agudos do chumbo em O. niloticus após a exposição hídrica de 96h foram avaliados através das concentrações nominais de 100 e 300 µg.l-1. A dose e as concentrações usadas neste trabalho foram determinadas a partir de estudos em áreas impactadas por chumbo, devido principalmente a atividades de mineração e metalurgia (Alto Vale do rio Ribeira nos estados brasileiros de São Paulo e Paraná). Para investigar os efeitos da exposição ao chumbo, em ambas as espécies, foram utilizados diferentes biomarcadores morfológicos (aspectos histológicos e ultra-estruturais) e bioquímicos (aspectos moleculares: atividades enzimáticas). Para o tratamento crônico e trófico empregou-se a inbição colinesterásica como parâmetro neurotóxico, de acordo com ELLMAN (1961) e a microscopia de luz e eletrônica de transmissão para se avaliar as alterações na estrutura do fígado de H. malabaricus. As amostras para histologia foram fixadas em Bouin a coradas com Hematoxilina- Eosina ou azul de toluidina. Para microscopia eletrônica de transmissão foram usados glutaraldeído a 2,5%, paraformaldeído a 4,0% em tampão cacodilato a 0,1M, pH 7,2 como solução fixadora por 2h, seguida de pós-fixação com tetróxido de ósmio a 1% na mesma solução tampão, ambas a temperatura ambiente. Para o experimento agudo por via hídrica foi analisada a inibição da 8- aminolevulinato desidratase (Delta-ALA-d) eritrocitária de O. niloticus, de acordo com HODSON (1976) e Bainy (1990) e a superfície do epitélio branquial por microscopia eletrônica de varredura, com as amostras fixadas em glutaraldeído a 3,0% em tampão cacodilato a 0,1M, pH 7,2. Os resultados mostraram que o chumbo é capaz de inibir a atividade catalítica da Delta-ALA-d, quando esta foi comparada com o grupo controle, para ambas as concentrações testadas em O. niloticus. Alterações morfológicas foram evidentes na ultra-estrutura do fígado de H. malabaricus após 4 e 8 doses ingeridas. A atividade da Delta-ALA-d é uma especifica e sensível estimativa para efeitos do chumbo após doses subletais a O. niloticus e este parâmetro foi considerado o melhor biomarcador testado neste trabalho, confirmando seu uso potencial para estudos adicionais em áreas contaminadas no Brasil. Os efeitos morfológicos do chumbo em H. malabaricus não são mencionados na literatura especializada, mas se parecem com os efeitos de outros metais pesados.Abstract: In the present work, two freshwater species, Hoplias malabaricus and Oreochromis niloticus, were exposed to experimental conditions to study the effects of inorganic lead (IT) after respectively trophic (chronic) and waterborne (acute) expositions. The trophic and chronic exposure to lead (II) on H. malabaricus was mounted with nominal ingested dose of 21 µg Pb++.g-1 each 120h, and the samples were removed after 4 doses (18 days) and 8 doses (41 days). The acute effects of lead after waterborne exposition to O. niloticus, were studied after 96 hours of exposure time at 100 and 300 µg.l -1 nominal concentrations. Dose and concentrations used in this work were determined from studies in impacted areas by lead, mainly due to mining and metallurgic activities (High Valley of Ribeira River, in São Paulo and Paraná States, Brazil). Differents biomarkers using morphological (histological and ultrastructural aspects) and biochemical (enzyme activity aspects), were used to investigate the effects of lead exposure to both freshwater species. For chronic and trophic treatment, were used cholinesterase inhibition as neurotoxic parameter according to ELLMAN (1961), and light and transmission electronic microscopy to evaluate the alterations on liver structure. Samples for histological studies were fixed in Bouin and stained in Haematoxilin/Eosin or toluidine blue stains and for electronic microscopy studies were used glutaraldehyde (2,5%), paraformaldehyde (4,0%) in cacodylate buffer (0,1M) (pH 7,2) as fixative solution for 2 hours and post fixed in 1% osmium tetroxide in the same buffer for 1 hour, both at room temperature. For the waterborne experiment, were studied erythrocyte 6- amino levulinic acid dehydratase (Delta-ALA-d) inhibition according to HODSON (1976) and BAINY (1990), and the surface of gill epithelium using scanning electron microscopy, respectively as biochemical and morphological biomarkers to O. Niloticus. For scanning electron microscopy, samples were fixed in glutaraldehyde (3,0%) in cacodylate buffer (0,1M) (pH 7,2). The results showed that lead is able to inhibit Delta-ALA-d activity when compared with the control group in both nominal concentrations tested on O. niloticus. Morphological alterations on liver ultrastructure are evident to H. malabaricus after 4 and 8 doses. The Delta-ALA-d activity is a specific and sensitive estimates of lead effects after sublethal doses to O. niloticus, and this enzyme's activity was considered to the best biomarker tested in this work, confirming its potential use in further studies in contaminated areas in Brazil. The morphological effects of lead to H. malabaricus have not been mentioned in the literature, but are closed to other heavy metals effects

Padronização de metodologias para o uso de biomarcadores de contaminação ambiental em traíra (Hoplias malabaricus, Erythrinidae) : -ALAd, metalotioneína e vitelogenina

Orientador : Ciro Alberto de Oliveira RibeiroCo-orientadora : Helena Cristina da Silva de AssisInclui apêndicesTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2006Inclui bibliografia e anexoÁrea de concentração: Biologia celular e molecularResumo: Biomarcador é aqui considerado uma resposta fisiológica individual do organismo, como conseqüência (efeito) da exposição (causa) do animal a um agente exógeno, contaminante ou substância tóxica. Esta tese trata da padronização de metodologias que envolvem técnicas laboratoriais bioquímicas e de biologia molecular para o emprego de biomarcadores em Hoplias malabaricus (traíra), a saber: cinética enzimática e constatação de inibição da - aminolevulinato desidratase, esta associada ao monitoramento de parâmetros hematológicos; quantificação indireta dos teores teciduais (fígado e brânquias) de metalotioneína; e quantificação relativa da vitelogenina plasmática (in vivo) ou sintetizada in vitro por cultivo primário de hepatócitos, através da imunodetecção da proteína por anti-soro policlonal produzido em coelhos. Outrossim, no que concerne à expressão da vitelogenina, foi descrita a definição conceitual, bem como realizada a demonstração empírica de um modelo matemático (Índice Vitelogênico utilizado como biomarcador) para a quantificação de efeitos estrogênicos ou anti-estrogênicos em peixes. A traíra foi utilizada como modelo experimental para bioensaios, nos quais foram consideradas condições fisicoquímicas próximas a de ambientes tropicais, a exposição via alimento por longos períodos (subcrônica) e a busca de respostas detectáveis e consistentes, que permitam a utilização da espécie em futuros estudos de biomonitoramento ambiental. Ensaios in vitro permitiram estabelecer um teste de estrogenicidade empregando hepatócitos de traíra, e a quantificação dessa resposta, considerando diferentes mecanismos moleculares de citotoxicidade. Os resultados aqui obtidos e comparados com outros estudos em peixes revelam que a eficiência do uso de biomarcadores é dependente de estudos prévios (in vivo e in vitro) que considerem os vários processos celulares e fisiológicos como relacionados reciprocamente e integrantes de um sistema único, o organismo.Abstract: A biomarker is defined as a change in a biological response (ranging from molecular through cellular and physiological responses) which can be related to exposure to or toxic effects of environmental chemicals or any biological response to an environmental chemical at the subindividual level, indicating a deviation from the normal status that cannot be detected in the intact organism. This thesis concerns about methodology standardizing of biochemical and molecular procedures that allows the employment of biomarkers in Hoplias malabaricus (traíra), as follows: enzymatic kinetics and inhibition of -aminolevulinic acid dehydratase; hematological measurements; indirect quantifying metallothioneins in liver and gill tissues; estrogenic priming, isolation and immunochemical detection (polyclonal antisera) of vitellogenin from plasma (bioassays), or from in vitro vitellogenin production by hepatocytes. This protein production has also been used in in vitro experiments, which showed the vitellogenic index as applicable screening method for determining (anti)estrogenic activity of xenobiotics. The use of those parameters as sensitive and long-term biomarkers for sublethal, subchronic, and trophic exposures to inorganic lead (II) or methylmercury was investigated in Hoplias malabaricus, as well as a sensitive biomarkers discussed here in relation to their feasibility in fish exposure to metals assessment. According to the current results, due to its high-level trophic position and wide geographical distribution in South America, we are suggesting the use of these biomarkers in biomonitoring programs of freshwater areas impacted by lead and mercury

Biomarcadores de contaminação em peixes de água doce, por exposição ao chumbo (II) : ensaios laboratoriais com Hoplias malabaricus e Oreochromis niloticus

Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira RibeiroCoorientadora: Prof.ª Dr.ª Helena Cristina da Silva de AssisDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia CelularInclui referências: p. 123-129Resumo: No presente trabalho duas espécies de peixes de água doce, Hoplias malabaricus (traíra) e Oreochromis niloticus (tilápia), foram expostas a condições experimentais para o estudo dos efeitos tóxicos do Chumbo (II), após as exposições trófica (crônica) e hídrica (aguda), respectivamente. A exposição trófica e crônica de H. malabaricus ao Chumbo (II) foi realizada com a dose nominal ingerida de 21 µg Pb ++.g-1 a cada 120h e as amostras de material biológico foram coletadas após 4 doses (18 dias) e 8 doses (41 dias). Os efeitos agudos do chumbo em O. niloticus após a exposição hídrica de 96h foram avaliados através das concentrações nominais de 100 e 300 µg.l-1. A dose e as concentrações usadas neste trabalho foram determinadas a partir de estudos em áreas impactadas por chumbo, devido principalmente a atividades de mineração e metalurgia (Alto Vale do rio Ribeira nos estados brasileiros de São Paulo e Paraná). Para investigar os efeitos da exposição ao chumbo, em ambas as espécies, foram utilizados diferentes biomarcadores morfológicos (aspectos histológicos e ultra-estruturais) e bioquímicos (aspectos moleculares: atividades enzimáticas). Para o tratamento crônico e trófico empregou-se a inbição colinesterásica como parâmetro neurotóxico, de acordo com ELLMAN (1961) e a microscopia de luz e eletrônica de transmissão para se avaliar as alterações na estrutura do fígado de H. malabaricus. As amostras para histologia foram fixadas em Bouin a coradas com Hematoxilina- Eosina ou azul de toluidina. Para microscopia eletrônica de transmissão foram usados glutaraldeído a 2,5%, paraformaldeído a 4,0% em tampão cacodilato a 0,1M, pH 7,2 como solução fixadora por 2h, seguida de pós-fixação com tetróxido de ósmio a 1% na mesma solução tampão, ambas a temperatura ambiente. Para o experimento agudo por via hídrica foi analisada a inibição da 8- aminolevulinato desidratase (Delta-ALA-d) eritrocitária de O. niloticus, de acordo com HODSON (1976) e Bainy (1990) e a superfície do epitélio branquial por microscopia eletrônica de varredura, com as amostras fixadas em glutaraldeído a 3,0% em tampão cacodilato a 0,1M, pH 7,2. Os resultados mostraram que o chumbo é capaz de inibir a atividade catalítica da Delta-ALA-d, quando esta foi comparada com o grupo controle, para ambas as concentrações testadas em O. niloticus. Alterações morfológicas foram evidentes na ultra-estrutura do fígado de H. malabaricus após 4 e 8 doses ingeridas. A atividade da Delta-ALA-d é uma especifica e sensível estimativa para efeitos do chumbo após doses subletais a O. niloticus e este parâmetro foi considerado o melhor biomarcador testado neste trabalho, confirmando seu uso potencial para estudos adicionais em áreas contaminadas no Brasil. Os efeitos morfológicos do chumbo em H. malabaricus não são mencionados na literatura especializada, mas se parecem com os efeitos de outros metais pesados.Abstract: In the present work, two freshwater species, Hoplias malabaricus and Oreochromis niloticus, were exposed to experimental conditions to study the effects of inorganic lead (IT) after respectively trophic (chronic) and waterborne (acute) expositions. The trophic and chronic exposure to lead (II) on H. malabaricus was mounted with nominal ingested dose of 21 µg Pb++.g-1 each 120h, and the samples were removed after 4 doses (18 days) and 8 doses (41 days). The acute effects of lead after waterborne exposition to O. niloticus, were studied after 96 hours of exposure time at 100 and 300 µg.l -1 nominal concentrations. Dose and concentrations used in this work were determined from studies in impacted areas by lead, mainly due to mining and metallurgic activities (High Valley of Ribeira River, in São Paulo and Paraná States, Brazil). Differents biomarkers using morphological (histological and ultrastructural aspects) and biochemical (enzyme activity aspects), were used to investigate the effects of lead exposure to both freshwater species. For chronic and trophic treatment, were used cholinesterase inhibition as neurotoxic parameter according to ELLMAN (1961), and light and transmission electronic microscopy to evaluate the alterations on liver structure. Samples for histological studies were fixed in Bouin and stained in Haematoxilin/Eosin or toluidine blue stains and for electronic microscopy studies were used glutaraldehyde (2,5%), paraformaldehyde (4,0%) in cacodylate buffer (0,1M) (pH 7,2) as fixative solution for 2 hours and post fixed in 1% osmium tetroxide in the same buffer for 1 hour, both at room temperature. For the waterborne experiment, were studied erythrocyte 6- amino levulinic acid dehydratase (Delta-ALA-d) inhibition according to HODSON (1976) and BAINY (1990), and the surface of gill epithelium using scanning electron microscopy, respectively as biochemical and morphological biomarkers to O. Niloticus. For scanning electron microscopy, samples were fixed in glutaraldehyde (3,0%) in cacodylate buffer (0,1M) (pH 7,2). The results showed that lead is able to inhibit Delta-ALA-d activity when compared with the control group in both nominal concentrations tested on O. niloticus. Morphological alterations on liver ultrastructure are evident to H. malabaricus after 4 and 8 doses. The Delta-ALA-d activity is a specific and sensitive estimates of lead effects after sublethal doses to O. niloticus, and this enzyme's activity was considered to the best biomarker tested in this work, confirming its potential use in further studies in contaminated areas in Brazil. The morphological effects of lead to H. malabaricus have not been mentioned in the literature, but are closed to other heavy metals effects

Padronização de metodologias para o uso de biomarcadores de contaminação ambiental em traíra (Hoplias malabaricus, Erythrinidae) : -ALAd, metalotioneína e vitelogenina

Orientador : Ciro Alberto de Oliveira RibeiroCo-orientadora : Helena Cristina da Silva de AssisInclui apêndicesTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2006Inclui bibliografia e anexoÁrea de concentração: Biologia celular e molecularResumo: Biomarcador é aqui considerado uma resposta fisiológica individual do organismo, como conseqüência (efeito) da exposição (causa) do animal a um agente exógeno, contaminante ou substância tóxica. Esta tese trata da padronização de metodologias que envolvem técnicas laboratoriais bioquímicas e de biologia molecular para o emprego de biomarcadores em Hoplias malabaricus (traíra), a saber: cinética enzimática e constatação de inibição da - aminolevulinato desidratase, esta associada ao monitoramento de parâmetros hematológicos; quantificação indireta dos teores teciduais (fígado e brânquias) de metalotioneína; e quantificação relativa da vitelogenina plasmática (in vivo) ou sintetizada in vitro por cultivo primário de hepatócitos, através da imunodetecção da proteína por anti-soro policlonal produzido em coelhos. Outrossim, no que concerne à expressão da vitelogenina, foi descrita a definição conceitual, bem como realizada a demonstração empírica de um modelo matemático (Índice Vitelogênico utilizado como biomarcador) para a quantificação de efeitos estrogênicos ou anti-estrogênicos em peixes. A traíra foi utilizada como modelo experimental para bioensaios, nos quais foram consideradas condições fisicoquímicas próximas a de ambientes tropicais, a exposição via alimento por longos períodos (subcrônica) e a busca de respostas detectáveis e consistentes, que permitam a utilização da espécie em futuros estudos de biomonitoramento ambiental. Ensaios in vitro permitiram estabelecer um teste de estrogenicidade empregando hepatócitos de traíra, e a quantificação dessa resposta, considerando diferentes mecanismos moleculares de citotoxicidade. Os resultados aqui obtidos e comparados com outros estudos em peixes revelam que a eficiência do uso de biomarcadores é dependente de estudos prévios (in vivo e in vitro) que considerem os vários processos celulares e fisiológicos como relacionados reciprocamente e integrantes de um sistema único, o organismo.Abstract: A biomarker is defined as a change in a biological response (ranging from molecular through cellular and physiological responses) which can be related to exposure to or toxic effects of environmental chemicals or any biological response to an environmental chemical at the subindividual level, indicating a deviation from the normal status that cannot be detected in the intact organism. This thesis concerns about methodology standardizing of biochemical and molecular procedures that allows the employment of biomarkers in Hoplias malabaricus (traíra), as follows: enzymatic kinetics and inhibition of -aminolevulinic acid dehydratase; hematological measurements; indirect quantifying metallothioneins in liver and gill tissues; estrogenic priming, isolation and immunochemical detection (polyclonal antisera) of vitellogenin from plasma (bioassays), or from in vitro vitellogenin production by hepatocytes. This protein production has also been used in in vitro experiments, which showed the vitellogenic index as applicable screening method for determining (anti)estrogenic activity of xenobiotics. The use of those parameters as sensitive and long-term biomarkers for sublethal, subchronic, and trophic exposures to inorganic lead (II) or methylmercury was investigated in Hoplias malabaricus, as well as a sensitive biomarkers discussed here in relation to their feasibility in fish exposure to metals assessment. According to the current results, due to its high-level trophic position and wide geographical distribution in South America, we are suggesting the use of these biomarkers in biomonitoring programs of freshwater areas impacted by lead and mercury