Measurement of expansin activity and plant cell wall creep by using a commercial texture analyzer

Background: Expansins play an important role in cell wall metabolism and fruit softening. Determination of expansin activity is a challenging problem since it depends on measuring cell wall properties by using ad hoc extensometers, a fact that has strongly restricted its study. Then, the objective of the work was to adapt a methodology to measure cell wall creep and expansin activity using a commercial texture meter, equipped with miniature tensile grips and an ad hoc cuvette of easy construction. Results: It was possible to measure hypocotyls acid growth and expansin activity in a reliable and reproducible way, using a commercial texture meter, common equipment found in laboratories of food science or postharvest technology. Expansin activity was detected in protein extracts from cucumber hypocotyls, tomato and strawberry fruits, and statistical differences in expansin activity were found in both fruit models at different ripening stages. Conclusions: The possibility of measuring expansin activity following this adapted protocol with a commercial texture meter could contribute to ease and increase the analysis of expansin in different systems, leading to a better understanding of the properties of these proteins under different experimental conditions.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Caracterización de las propiedades de unión in vitro de FAPG1 sobre diferentes polisacáridos de la pared celular

El ablandamiento excesivo de los frutos carnosos limita su vida poscosecha influyendo en la preferencia de los consumidores. La firmeza de un fruto está condicionada por varios factores, siendo uno de los principales la rigidez mecánica determinada por la pared celular la cual está constituida por una red de microfibrillas de celulosa inmersas en una compleja matriz de pectinas y hemicelulosas. Durante la maduración, la acción combinada de diferentes proteínas y enzimas hidrolíticas que actúan sobre los componentes de la pared celular provoca una disminución del contenido, solubilización y depolimerización de los distintos componentes. La disminución y relajación de esta barrera mecánica no sólo disminuye la firmeza del fruto sino que también facilita el ataque microorganismos patógenos, lo cual acorta la vida poscosecha del fruto. En los últimos años se ha acumulado evidencia que indica que el ablandamiento de la frutilla está estrechamente ligado a la degradación de las pectinas, a diferencia de lo que ocurre en otros frutos como tomate. La mayoría de las glicosil hidrolasas tienen una arquitectura molecular formada por un sitio catalítico, un módulo de unión a carbohidrato y un péptido señal que las dirige a pared celular. Aún no se han caracterizado las propiedades de unión de FaPG1 a carbohidratos de pared celular ni se ha descripto la existencia de un módulo de unión a carbohidratos o región de unión a pectinas para ninguna poligacturonasa. En este trabajo clonamos la proteína FaPG1 y dos fragmentos de la misma, RC-FaPG1 (región que contiene el dominio endo-poliglucanasa) y RN-FaPG1 (complementaria a FC-FaPG1), en un vector de expresión en Escherichia coli para obtener las proteínas recombinantes correspondientes. Las tres proteínas recombinantes solubles en buffer con agente caotrópico (Sarkosyl), utilizado en la purificación, precipitaron cuando se intentó remover dicho agente en buffers de distinto pH y fuerza iónica. Únicamente logramos estabilizar dichas proteínas en presencia de su sustrato Ácido poligalacturónico (PGA) y de esta forma logramos ensayar la capacidad de unión de cada una de ellas a dicho polímero. Hasta el momento hemos podido concluir: La proteína completa permaneció estable aún a bajas concentraciones de PGA mientras que el dominio catalítico perdió abruptamente su estabilidad a bajas concentraciones de PGA. El fragmento no catalítico permaneció estable a concentraciones aún más bajas de PGA. Esto sugiere una posible interacción de la región no catalítica con el sustrato (PGA).Universidad Nacional de La Plat

Caracterización de las propiedades de unión in vitro de FAPG1 sobre diferentes polisacáridos de la pared celular

El ablandamiento excesivo de los frutos carnosos limita su vida poscosecha influyendo en la preferencia de los consumidores. La firmeza de un fruto está condicionada por varios factores, siendo uno de los principales la rigidez mecánica determinada por la pared celular la cual está constituida por una red de microfibrillas de celulosa inmersas en una compleja matriz de pectinas y hemicelulosas. Durante la maduración, la acción combinada de diferentes proteínas y enzimas hidrolíticas que actúan sobre los componentes de la pared celular provoca una disminución del contenido, solubilización y depolimerización de los distintos componentes. La disminución y relajación de esta barrera mecánica no sólo disminuye la firmeza del fruto sino que también facilita el ataque microorganismos patógenos, lo cual acorta la vida poscosecha del fruto. En los últimos años se ha acumulado evidencia que indica que el ablandamiento de la frutilla está estrechamente ligado a la degradación de las pectinas, a diferencia de lo que ocurre en otros frutos como tomate. La mayoría de las glicosil hidrolasas tienen una arquitectura molecular formada por un sitio catalítico, un módulo de unión a carbohidrato y un péptido señal que las dirige a pared celular. Aún no se han caracterizado las propiedades de unión de FaPG1 a carbohidratos de pared celular ni se ha descripto la existencia de un módulo de unión a carbohidratos o región de unión a pectinas para ninguna poligacturonasa. En este trabajo clonamos la proteína FaPG1 y dos fragmentos de la misma, RC-FaPG1 (región que contiene el dominio endo-poliglucanasa) y RN-FaPG1 (complementaria a FC-FaPG1), en un vector de expresión en Escherichia coli para obtener las proteínas recombinantes correspondientes. Las tres proteínas recombinantes solubles en buffer con agente caotrópico (Sarkosyl), utilizado en la purificación, precipitaron cuando se intentó remover dicho agente en buffers de distinto pH y fuerza iónica. Únicamente logramos estabilizar dichas proteínas en presencia de su sustrato Ácido poligalacturónico (PGA) y de esta forma logramos ensayar la capacidad de unión de cada una de ellas a dicho polímero. Hasta el momento hemos podido concluir: La proteína completa permaneció estable aún a bajas concentraciones de PGA mientras que el dominio catalítico perdió abruptamente su estabilidad a bajas concentraciones de PGA. El fragmento no catalítico permaneció estable a concentraciones aún más bajas de PGA. Esto sugiere una posible interacción de la región no catalítica con el sustrato (PGA).Universidad Nacional de La Plat

Caracterización de las propiedades de unión in vitro de FAPG1 sobre diferentes polisacáridos de la pared celular

El ablandamiento excesivo de los frutos carnosos limita su vida poscosecha influyendo en la preferencia de los consumidores. La firmeza de un fruto está condicionada por varios factores, siendo uno de los principales la rigidez mecánica determinada por la pared celular la cual está constituida por una red de microfibrillas de celulosa inmersas en una compleja matriz de pectinas y hemicelulosas. Durante la maduración, la acción combinada de diferentes proteínas y enzimas hidrolíticas que actúan sobre los componentes de la pared celular provoca una disminución del contenido, solubilización y depolimerización de los distintos componentes. La disminución y relajación de esta barrera mecánica no sólo disminuye la firmeza del fruto sino que también facilita el ataque microorganismos patógenos, lo cual acorta la vida poscosecha del fruto. En los últimos años se ha acumulado evidencia que indica que el ablandamiento de la frutilla está estrechamente ligado a la degradación de las pectinas, a diferencia de lo que ocurre en otros frutos como tomate. La mayoría de las glicosil hidrolasas tienen una arquitectura molecular formada por un sitio catalítico, un módulo de unión a carbohidrato y un péptido señal que las dirige a pared celular. Aún no se han caracterizado las propiedades de unión de FaPG1 a carbohidratos de pared celular ni se ha descripto la existencia de un módulo de unión a carbohidratos o región de unión a pectinas para ninguna poligacturonasa. En este trabajo clonamos la proteína FaPG1 y dos fragmentos de la misma, RC-FaPG1 (región que contiene el dominio endo-poliglucanasa) y RN-FaPG1 (complementaria a FC-FaPG1), en un vector de expresión en Escherichia coli para obtener las proteínas recombinantes correspondientes. Las tres proteínas recombinantes solubles en buffer con agente caotrópico (Sarkosyl), utilizado en la purificación, precipitaron cuando se intentó remover dicho agente en buffers de distinto pH y fuerza iónica. Únicamente logramos estabilizar dichas proteínas en presencia de su sustrato Ácido poligalacturónico (PGA) y de esta forma logramos ensayar la capacidad de unión de cada una de ellas a dicho polímero. Hasta el momento hemos podido concluir: La proteína completa permaneció estable aún a bajas concentraciones de PGA mientras que el dominio catalítico perdió abruptamente su estabilidad a bajas concentraciones de PGA. El fragmento no catalítico permaneció estable a concentraciones aún más bajas de PGA. Esto sugiere una posible interacción de la región no catalítica con el sustrato (PGA).Universidad Nacional de La Plat

Characterization of Mg-dechelating substance in senescent and pre-senescent Arabidopsis thaliana leaves

The removal of Mg2+ is an important step in the chlorophyll degradation pathway and extracts from senescent and presenescent Arabidopsis thaliana leaves were analyzed for Mg-dechelatase activity, using chlorophyllin, an artificial derivative of the natural substrate, chlorophyllide. The optimum temperature and pH for this reaction were determined to be at approximately 50 °C and 7.2, respectively. Mg-dechelatase activity was enhanced by addition of EDTA and inhibited by MgCl2, HgCl2 and reduced glutathione, indicating phenomenons such as retroinhibition by reaction products and dependence on the redox state of the mixture. Size exclusion chromatography was performed on Arabidopsis leaf extracts, and Mg-dechelatase activity was found in the fraction corresponding to molecular mass of about 42 kDa, which indicates that the Mg-dechelating compound in Arabidopsis is considerably larger than in other systems. During dark-induced senescence, the activity increased over time until reaching a maximum at day 4, and then decreased. The addition of plant growth regulators indicated that the accumulation of Mg-dechelatase was activated by ethylene and delayed by 6-benzylaminopurine.Instituto de Fisiología Vegeta

Efecto de la sobreexpresión del CBM del gen de expansina 1 (LeExp1) de tomate sobre la calidad y el ablandamiento del fruto

Elaborar una estrategia que permita controlar la degradación de la pared celular y el ablandamiento de frutos, mediante la sobreexpresión de CBMs en la pared celular, empleando tomate como sistema modelo.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Efecto del tratamiento postcosecha 1-MCP/CaCl₂ en la expresión de genes del metabolismo de la pared celular de frutilla

Debido a su textura delicada y velocidad elevada de ablandamiento, la frutilla, presenta una gran susceptibilidad al ataque por patógenos lo que reduce el tiempo de vida comercial de estos frutos. Por estos motivos, es de interés el desarrollo de tratamientos capaces de retrasar el desensamblaje de la pared celular, y el consecuente ablandamiento, durante la postcosecha de frutilla. En un trabajo previo realizado por nuestro grupo de investigación, se halló que frutos tratados con 1-metilciclopropeno (1-MCP) y con CaCl₂ y almacenados 10 días a 4 °C y 2 días a 20 °C, eran más firmes, presentaban un mayor contenido tanto de pectinas unidas por interacciones débiles e iónicas, así como de hemicelulosas en sus paredes celulares y eran más resistentes al ataque por Botrytis cinerea que los frutos controles. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del tratamiento 1-MCP/CaCl₂ sobre la expresión de genes vinculados con el metabolismo de los polímeros constituyentes de la pared celular de frutilla. Para ello se utilizaron 400 frutos del cultivar Aroma cosechados en estadio de madurez comercial, los cuales se dividieron en 4 grupos: Control: 18 h aire, 20 °C + 30 min en agua, 25 °C; T1: 18 h aire, 20 °C + 30 min en CaCl₂ 1% p/v, 25 °C; T2: 18 h 1-MPC 1 ppm, 20 °C + 30 min en agua, 25 °C; y T3: 18 h 1-MCP 1 ppm, 20 °C + 30 min en CaCl₂ 1% p/v, 25 °C. Se tomaron muestras tanto inmediatamente después de los tratamientos (tiempo inicial, Ti) como luego de un almacenamiento de 10 días a 4 °C + 2 días a 20 °C (tiempo final, Tf). Mediante la técnica de PCR en Tiempo Real se midió la expresión de genes relevantes en el metabolismo de pectinas: poligalacturonasa (FaPG1) y pectin metilesterasa (FaPME1); y de hemicelulosas: xiloglucano endotransglicosilasa (FaXTH1) y xilosidasa (FaXyl1). Inmediatamente después de los tratamientos (Ti), se observó una expresión significativamente mayor de FaPME1 y una expresión significativamente menor de FaPG1 en los frutos T1, T2 y T3, respecto a los controles. Por otro lado, la expresión FaXTH1 fue significativamente mayor en frutos sometidos a los tratamientos individuales y combinado, respecto al control. Es de destacar que estos efectos fueron más marcados en frutos sometidos a los tratamientos con 1-MCP (T2) y combinado (T3). Respecto al gen FaXyl1 no se encontraron diferencias significativas en la expresión de mismo entre frutos tratados y controles. Estos resultados se encuentran estrechamente vinculados con el mayor contenido de pectinas de interacciones iónicas y débiles, así como de hemicelulosas registrados previamente.Trabajo publicado en Castagnini, Juan Manuel; Luz Marina Zapata; Liliana Mabel Gerard (eds.). Libro de Trabajos Completos I Congreso Argentino de Biología y Tecnología Poscosecha. IX Jornadas Argentinas de Biología y Tecnología Poscosecha. Paraná: Universidad Nacional de Entre Ríos, 2018.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Efecto del tratamiento postcosecha 1-MCP/CaCl₂ en la expresión de genes del metabolismo de la pared celular de frutilla

Debido a su textura delicada y velocidad elevada de ablandamiento, la frutilla, presenta una gran susceptibilidad al ataque por patógenos lo que reduce el tiempo de vida comercial de estos frutos. Por estos motivos, es de interés el desarrollo de tratamientos capaces de retrasar el desensamblaje de la pared celular, y el consecuente ablandamiento, durante la postcosecha de frutilla. En un trabajo previo realizado por nuestro grupo de investigación, se halló que frutos tratados con 1-metilciclopropeno (1-MCP) y con CaCl₂ y almacenados 10 días a 4 °C y 2 días a 20 °C, eran más firmes, presentaban un mayor contenido tanto de pectinas unidas por interacciones débiles e iónicas, así como de hemicelulosas en sus paredes celulares y eran más resistentes al ataque por Botrytis cinerea que los frutos controles. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del tratamiento 1-MCP/CaCl₂ sobre la expresión de genes vinculados con el metabolismo de los polímeros constituyentes de la pared celular de frutilla. Para ello se utilizaron 400 frutos del cultivar Aroma cosechados en estadio de madurez comercial, los cuales se dividieron en 4 grupos: Control: 18 h aire, 20 °C + 30 min en agua, 25 °C; T1: 18 h aire, 20 °C + 30 min en CaCl₂ 1% p/v, 25 °C; T2: 18 h 1-MPC 1 ppm, 20 °C + 30 min en agua, 25 °C; y T3: 18 h 1-MCP 1 ppm, 20 °C + 30 min en CaCl₂ 1% p/v, 25 °C. Se tomaron muestras tanto inmediatamente después de los tratamientos (tiempo inicial, Ti) como luego de un almacenamiento de 10 días a 4 °C + 2 días a 20 °C (tiempo final, Tf). Mediante la técnica de PCR en Tiempo Real se midió la expresión de genes relevantes en el metabolismo de pectinas: poligalacturonasa (FaPG1) y pectin metilesterasa (FaPME1); y de hemicelulosas: xiloglucano endotransglicosilasa (FaXTH1) y xilosidasa (FaXyl1). Inmediatamente después de los tratamientos (Ti), se observó una expresión significativamente mayor de FaPME1 y una expresión significativamente menor de FaPG1 en los frutos T1, T2 y T3, respecto a los controles. Por otro lado, la expresión FaXTH1 fue significativamente mayor en frutos sometidos a los tratamientos individuales y combinado, respecto al control. Es de destacar que estos efectos fueron más marcados en frutos sometidos a los tratamientos con 1-MCP (T2) y combinado (T3). Respecto al gen FaXyl1 no se encontraron diferencias significativas en la expresión de mismo entre frutos tratados y controles. Estos resultados se encuentran estrechamente vinculados con el mayor contenido de pectinas de interacciones iónicas y débiles, así como de hemicelulosas registrados previamente.Trabajo publicado en Castagnini, Juan Manuel; Luz Marina Zapata; Liliana Mabel Gerard (eds.). Libro de Trabajos Completos I Congreso Argentino de Biología y Tecnología Poscosecha. IX Jornadas Argentinas de Biología y Tecnología Poscosecha. Paraná: Universidad Nacional de Entre Ríos, 2018.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Efecto de la sobreexpresión del CBM del gen de expansina 1 (LeExp1) de tomate sobre la calidad y el ablandamiento del fruto

Elaborar una estrategia que permita controlar la degradación de la pared celular y el ablandamiento de frutos, mediante la sobreexpresión de CBMs en la pared celular, empleando tomate como sistema modelo.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Efecto de la sobreexpresión del CBM del gen de expansina 1 (LeExp1) de tomate sobre la calidad y el ablandamiento del fruto

Elaborar una estrategia que permita controlar la degradación de la pared celular y el ablandamiento de frutos, mediante la sobreexpresión de CBMs en la pared celular, empleando tomate como sistema modelo.Facultad de Ciencias Agrarias y Forestale