Investigação da autoimunidade em camundongos com mucopolissacaridose tipo 1

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença herdada de forma autossômica recessiva. É causada pela deficiência da enzima alfa-L-iduronidase, que leva ao acúmulo intralisossômico de heparan e dermatan sulfato. Os sintomas são heterogêneos e pacientes com a forma mais grave da doença têm alterações neurocognitivas. O mecanismo de patogênese ainda é, em grande parte, desconhecido. Entretanto, há evidências crescentes da participação de alterações do sistema imune neste processo. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de resposta autoimmune e sua contribuição para os sintomas clínicos de camundongos com MPS I. Para verificar a ocorrência de autoantígenos em camundongos MPS I, extratos de proteína do hipocampo e fígado foram submetidos a western blot, e soro de camundongos afetados e normais foi usado como anticorpo primário. Os resultados mostraram que não há diferença entre animais normais e MPS I, indicando ausência de autoantígenos patológicos. Para verificar ativação anormal de células T em camundongos MPS I, linfócitos foram ativados com Concanavalina A e a proliferação foi verificada por ensaio de MTT. Os resultados mostraram proliferação normal de células T nos camundongos afetados. Para verificar o potencial patogênico de células T de animais MPS I, linfócitos destes foram ativados e transferidos para camundongos normais, que foram então submetidos a testes comportamentais para verificar atividade exploratória, locomoção e atividade cerebelar. Para isso foram utilizados testes de campo aberto e análise de caminhada. Os resultados obtidos mostraram comportamento similar ao de animais do grupo controle, que recebeu linfócitos de camundongos normais, e também de camundongos normais que não sofreram intervenção. Os receptores de linfócitos MPS I também não apresentaram evidência de neuroinflamação, resultado demonstrado por meio de imunohistoquímica para GFAP. Com os resultados obtidos neste trabalho sugere-se que características autoimunes não apresentam uma contribuição significativa para a patogênese da MPS I. Isso, porém, não exclui a existência de outras alterações imunológicas nesta doença. Por isso, uma caracterização mais detalhada do perfil imunológico de camundongos com MPS I é necessária.Mucopolysaccaridosis type I (MPS I) is an autosomal recessive disorder caused by the deficiency of alpha-L-iduronidase, leading to accumulation of heparan sulfate and dermatan sulfate within the lysosome. The clinical signs are heterogeneous, and patients with the severe form of disease exhibit neurological impairment. The mechanism of pathogenesis is unknown, but there is increasing evidence of the participation of immune system abnormalities on the pathology of MPS I. Therefore we conducted a study to verify the occurrence of autoimmune response and its contribution to the clinical symptoms of MPS I mice. Western blot analysis of protein extracts from liver and hippocampus demonstrated that there are no putatives autoantigens exclusive of MPS I mice. Lymphocyte proliferation assays showed normal T-cell activation in these animals. Lymphocyte transfer from MPS I mice to normal mice did not cause any damage to the central nervous system of receptor mice detectable by behavioral tests. Receptor animals also did not show signs of neuroinflammation, demonstrated by GFAP staining. The present study suggests that autoimmune reactions are not involved in the pathogenesis of MPS I. However the existence of other immune system abnormalities cannot be excluded. Therefore a more detailed characterization of immune profile of MPS I mice is required

Edição gênica em mucopolissacaridose tipo 1 utilizando o sistema CRISPR-Cas9

A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossômica de depósito (DLD) causada por mutações no gene da alfa-L-iduronidase (IDUA), enzima responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos dermatan e heparan sulfato. Os dois tratamentos disponíveis, terapia de reposição enzimática e transplante de células tronco hematopoiéticas, têm limitações importantes. Os sistemas de edição gênica que foram desenvolvidos nos últimos anos parecem ser alternativas promissoras para este tipo de doença. Entre eles, o sistema CRISPR-Cas9 tem se destacado. Descrito como uma forma de sistema imune de bactérias, ele foi adaptado para editar locais precisos do genoma humano e de outros eucariotos. O objetivo geral desta tese foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para a correção gênica em MPS I. No primeiro trabalho discutimos como a edição gênica pode ser aplicada no tratamento de diferentes DLD. Um dos principais fatores para que a modificação do DNA ocorra de forma eficiente é a entrega intracelular dos vetores em quantidade adequada. Para tanto, no segundo trabalho da tese, descrevemos um protocolo otimizado para transfecção de células tronco mesenquimais (CTM), que são células de difícil transfecção, com Lipofectamina® 3000. Utilizando CTM com poucas passagens, com aproximadamente 70 % de confluência e uma relação lipídeo/DNA de 3 μL/μg, obtivemos até 26 % de células transfectadas. O objetivo do terceiro trabalho da tese foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para corrigir in vitro uma das mutações mais comuns em pacientes com MPS I, responsável pelo fenótipo grave da doença. Fibroblastos humanos homozigotos para p.W402X foram transfectados e analisados por até um mês após o tratamento. A atividade de IDUA nas células transfectadas aumentou significativamente, houve uma diminuição no número e tamanho dos lisossomos, e o sequenciamento de nova geração mostrou que um percentual das células tratadas apresentava a sequência normal do gene da IDUA, confirmando que a mutação patogênica foi corrigida. São apresentados ainda resultados de um trabalho em andamento em que CRISPR-Cas9 e um vetor doador foram utilizados para inserir o cDNA completo da Idua em CTM extraídas de camundongos MPS I. Após seleção das células modificadas, a atividade enzimática alta mostrou que a sequência foi corretamente inserida. Os estudos desta tese são uma prova de conceito de que a edição gênica com CRISPR-Cas9 pode ser usada para correção de mutações responsáveis pela MPS I e abre a possibilidade de uso desta tecnologia como uma nova abordagem terapêutica em doenças de depósito lisossômico.Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease caused by mutations in the alpha-L-iduronidase (IDUA) gene, which encodes the enzyme responsible for degradation of glycosaminoglycans dermatan and heparan sulfate. The two available treatments, enzyme replacement therapy and hematopoietic stem cells transplantation, have important limitations. The gene editing technologies that have been developed in recent years are promising alternatives for this type of disease. Among them, the CRISPR-Cas9 system has excelled. Described as a form of bacterial immune system, it has been adapted for editing genes in precise points of the human and other eukaryotes genomes. Thus, the overall objective of this thesis was to use the CRISPR-Cas9 system for gene correction in MPS I. In the first study, we discussed how gene editing can be applied to the treatment of different LSD. One of the main factors influencing success of DNA modification is the delivery of vectors in proper amount into the cells. Therefore, in the second work, we described an optimized protocol with Lipofectamine® 3000 for transfection of mesenchymal stem cells (MSC), which are known to be difficult to transfect cells. Using MSC with few passages, approximately 70 % of cell confluency, and a relationship lipid/DNA of 3 μL/μg, we could achieve up to 26 % of transfected cells. The purpose of the third work of this thesis was to use the CRISPR-Cas9 system to correct in vitro one of the most common mutations in MPS I patients, responsible for severe MPS I phenotype. Human fibroblasts homozygous for p.W402X were transfected and analyzed for up to a month after treatment. IDUA activity in transfected cells increased significantly, there was a decrease in the number and size of lysosomes, and next generation sequencing showed that a percentage of treated cells presented the normal sequence of IDUA gene, confirming that the pathogenic mutation was corrected. We also report results from a work in progress in which CRISPR-Cas9 and a donor vector were used to insert the complete Idua cDNA in MSC extracted from MPS I mice After selection of modified cells, the high enzyme activity showed that the sequence was properly inserted. The studies in this thesis are a proof of concept that gene editing with CRISPR-Cas9 can be used to correct mutations responsible for MPS I, and opens the possibility of using this technology as a new therapeutic approach in lysosomal storage diseases

Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model

Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal disease caused by alpha-l-iduronidase (IDUA) deficiency. This study used IDUA knockout mice as a model to evaluate whether parameters such as dose of plasmid and time of treatment could influence the transfection efficiency of complexes formed with PEGylated cationic nanoemulsions and plasmid (pIDUA), which contains the gene that encodes for IDUA. Formulations were composed of medium chain triglycerides, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(amino[polyethylene glycol]-2000), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-trimethylammonium propane (DOTAP), glycerol, and water and were prepared by the adsorption or encapsulation of preformed pIDUA–DOTAP complexes by high-pressure homogenization. A progressive increase in IDUA expression was observed with an increase in the dose and time of transfection for mice treated with both complexes (adsorbed and encapsulated), especially in the liver. Regardless of the complex administered, a significant increase in IDUA activity was detected in lungs and liver compared with nontreated MPS I when a dose of 60 μg was administered and IDUA activity was measured 7 days postadministration. Tissue sections of major organs showed no presence of cell necrosis, inflammatory infiltrate, or an increase in apoptosis. Furthermore, immunohistochemistry for CD68 showed no difference in the number of macrophage cells in treated and nontreated animals, indicating the absence of inflammatory reaction caused by the treatment. The data set obtained in this study allowed establishing that factors such as dose and time can influence transfection efficiency in different degrees and that these complexes did not lead to any lethal effect in the MPS I murine model used

Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model

Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal disease caused by alpha-l-iduronidase (IDUA) deficiency. This study used IDUA knockout mice as a model to evaluate whether parameters such as dose of plasmid and time of treatment could influence the transfection efficiency of complexes formed with PEGylated cationic nanoemulsions and plasmid (pIDUA), which contains the gene that encodes for IDUA. Formulations were composed of medium chain triglycerides, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(amino[polyethylene glycol]-2000), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-trimethylammonium propane (DOTAP), glycerol, and water and were prepared by the adsorption or encapsulation of preformed pIDUA–DOTAP complexes by high-pressure homogenization. A progressive increase in IDUA expression was observed with an increase in the dose and time of transfection for mice treated with both complexes (adsorbed and encapsulated), especially in the liver. Regardless of the complex administered, a significant increase in IDUA activity was detected in lungs and liver compared with nontreated MPS I when a dose of 60 μg was administered and IDUA activity was measured 7 days postadministration. Tissue sections of major organs showed no presence of cell necrosis, inflammatory infiltrate, or an increase in apoptosis. Furthermore, immunohistochemistry for CD68 showed no difference in the number of macrophage cells in treated and nontreated animals, indicating the absence of inflammatory reaction caused by the treatment. The data set obtained in this study allowed establishing that factors such as dose and time can influence transfection efficiency in different degrees and that these complexes did not lead to any lethal effect in the MPS I murine model used