Analysis of the transcriptional activation and cross-regulatory functions of the p53 family members in tumour suppression by functional genomics

Kutatásainkat kiterjesztettük nem csak az emlős p53 család tagjaira, hanem a Drosophila melanogaster p53-ra (Dmp53) is. Kimutattuk, hogy a Dmp53 hiányos Drosophilák ultraibolya (UV) sugárzásra fokozottan érzékenyek. Dmp53 által indukált géneket azonosítottunk cDNS microarray technológiával, majd e célgének sugárzás általi indukcióját vizsgáltuk kvantitatív ""real time PCR"" technikával. Míg egyes gének (pl. hid) mind ionizáló, mind UV sugárzás hatására Dmp53-függő módon indukálódtak, más gének expressziója csak UV (pl. Ark) vagy csak ionizáló sugárzás esetén (pl. reaper) emelkedett meg. Eredményeink elsőként mutatják ki, hogy a Dmp53 különféle DNS károsodás hatására különféle célgéneket aktivál. A Dmp53-mal kölcsönható fehérjék azonosítására élesztő két-hibrid módszert alkalmaztunk. Az egyik azonosított kölcsönható partner a DLP (Daxx like protein). DLP mutáns állatokat előállítva megállapítottuk, hogy életképesek, de élettartamuk megrövidül, és csökkent fertilitástúak, továbbá, hogy a DLP részt vesz a Dmp53 transzkripciós és apoptotikus aktivitásának szabályozásában. Egy másik azonosított partner a TAF(II)155, melynek kölcsönhatását a humán p53-mal és p73-mal is kimutattuk. Megállapítottuk, hogy humán homológja, a TAF3 gátolja a humán p53 és p73 transzkripciós aktivitását és csökkenti a p53 fehérje szintjét. A Dmp53 új, evolúcionárisan konzervált szabályozóinak azonosításával új távlatokat nyitottunk meg a p53 tumor szupresszor és családtagjai szabályozásának megértésében. | We extended our studies not only to the mammalian family members of p53 but also to Drosophila melanogster p53 (Dmp53). We showed that Dmp53 deficient Drosophilas are highly sensitive to ultraviolet (UV) radiation. We identified genes induced by Dmp53 using cDNA microarray technology, then studied the radiation inducibility of these target genes employing quantitative real time PCR technique. While some genes (e.g. hid) were induced in a Dmp53-dependent way upon both ionizing and UV radiation, expression of other genes was elevated upon UV treatment only (e.g. Ark) or upon IR only (e.g. reaper). Our data are first to show that Dmp53 activates different target genes upon different types of DNA damage. In order to identify proteins interacting with Dmp53, we used the yeast two hybrid method. One of the identified interacting partners is DLP (Daxx like protein). We generated DLP mutant animals, and found that they are viable but have shortened lifespan, and reduced fertility. Furthermore, DLP participates in the regulation of the transcriptional and apoptotic activity of Dmp53. Another identified partner is TAF(II)155, and it can interact with human p53 and p73 as well. We showed that its human homolog, TAF3 inhibits the transcriptional activity of p53 and p73 and it reduces the level of the p53 protein. By identifying novel, evolutionarily conserved regulators of Dmp53, we opened new avenues to the understanding of the regulation of p53 tumor suppressor and its family members

A fehérjelebontás szerepének tanulmányozása a kromoszóma szegregáció és a mitózis szabályozásában = Determining the role of protein degradation in the regulation of chromosome segregation and mitosis

Az sejtciklus szabályozásában alapvető szerepet játszó komplex, az APC genetikai és molekuláris biológiai analízisét végeztük el elsőként egy soksejtű eukarióta modell organizmusban, az ecetmuslicában. Azonosítottuk a Drosophila APC komplexet alkotó tíz alegységet kódoló géneket. Ezek közül, P elemre épülő technikákkal, nyolc gén mutáns alléljait és transzgénikus RNSi vonalait sikerült előállítani és jellemezni. Egy kivételével valamennyi alegység funkciója nélkülözhetetlennek bizonyult az állatok egyedfejlődése szempontjából, és kiesésük jellegzetes mitótikus fenotípusok kialakulását eredményezte. Az egyes mutánsok esetében egymáshoz hasonló, de jelentősen eltérő fenotípus-jegyeket is kimutattunk. Ezekből arra következtettünk, hogy a különböző alegységeknek eltérő szerepe van a komplex funkciójának kialakításában. Genetikai és fizikai interakciókat is kimutattunk az egyes alegységek között, amelyek jó egyezést mutatnak az időközben megjelent szerkezetvizsgálati eredményekkel. Kimutattuk, hogy a két protein modifikációs rendszer, az ubiquitinálás és a sumoilálás funkcionálisan összefügg egymással. Kimutattuk, hogy a csak soksejtű eukariótákban található APC7 alegység egy hét TPR (tetratrico-peptide repeat) motívumot hordozó fehérje, amelynek funkciója, egyedüliként, nem eszenciális a teljes komplex funkciója szempontjából. Végezetül kidolgoztunk egy kísérleti rendszert a proteindegradáció követésére mind in vivo, mind pedig in vitro. | In this project we have accomplished the genetic and molecular biological analysis of the anaphase promoting complex, or APC, in a multicellular model organism, the fruit fly, Drosophila melanogaster. First, we identified all genes coding for ten subunits of the Drosophila APC. Mutant alleles and transgenic RNA interference lines corresponding to eight subunit genes were isolated and characterised. The function of all but one subunit proved to be essential for development, and their loss resulted in characteristic mitotic phenotypes. The significant differences in their mitotic phenotypes indicate that the subunits have distinct roles and they contribute differently to the functions of the whole complex. In addition to this, we have demonstrated genetic and physical interactions among subunits. These data are in good agreement with the physico-chemical data emerging from structural studies of the APC. We have shown that the two protein modification system, the ubiquitination and sumoilation are functionally related to each other. We have also shown that the APC7 subunit, found only in multicellular eukaryotes, contains seven TPR (tetratrico-peptide-repeat) repeats, and it is the only subunit whose function is not essential for the functioning of the whole complex. In the course of this project we established an experimental system to monitor protein degradation both in vivo and in vitro

Evolutionary mode for the functional preservation of fast-evolving Drosophila telomere capping proteins

DNA end protection is fundamental for the long-term preservation of the genome. In vertebrates the Shelterin protein complex protects telomeric DNA ends, thereby contributing to the maintenance of genome integrity. In the Drosophila genus, this function is thought to be performed by the Terminin complex, an assembly of fast-evolving subunits. Considering that DNA end protection is fundamental for successful genome replication, the accelerated evolution of Terminin subunits is counterintuitive, as conservation is supposed to maintain the assembly and concerted function of the interacting partners. This problem extends over Drosophila telomere biology and provides insight into the evolution of protein assemblies. In order to learn more about the mechanistic details of this phenomenon we have investigated the intra- and interspecies assemblies of Verrocchio and Modigliani, two Terminin subunits using in vitro assays. Based on our results and on homology-based three-dimensional models for Ver and Moi, we conclude that both proteins contain Ob-fold and contribute to the ssDNA binding of the Terminin complex. We propose that the preservation of Ver function is achieved by conservation of specific amino acids responsible for folding or localized in interacting surfaces. We also provide here the first evidence on Moi DNA binding

ADA2 tartalmú hiszton acetiltranszferáz komplexek szerepe a génműködés szabályozásában = The role of ADA2-containing histone acetyltransferase complexes in gene

A projekt eredményei hiszton módosító komplexek szerepét és együttműködését bizonyítják a génműködés és a kromoszóma szerkezet szabályozásában. Jellemeztük két rokon szerkezetű ADA2 fehérje faktort tartalmazó acetiltranszferáz komplex működését, melyek (SAGA és ATAC), szigorúan specifikusan módosítják a nukleoszóma hiszton komponenseit. A SAGA a hiszton 3 lizin 9 és 14, az ATAC a hiszton 4 lizin 5 és lizin 12 oldalláncokat acetilálja. Egy harmadik általunk jelemzett faktor (ADA3) mindkét komponens esszenciális része. A SAGA és ATAC komplexek egyes gének működését specifikus transzkripciós faktorokon át szabályozzák, az ATAC komplex pedig az aktív kromatin szerkezet kialakításán keresztül az általános génműködés szabályozásban is fontos szerepet játszik. Az ATAC működésével létrejövő hiszton 4 acatiláció hiányában csökken a JIL-1 hiszton kináz aktivitása és ez a transzkripciósan inaktív heterokromatin kialakulásának irányába tolja el a kromatin szerkezet változásokat. Ehhez kapcsolódva azt is kimutattuk, hogy a hiszton 4 ATAC-al történő acetilációjához egy másik nukleoszóma módosító komplex, az ATP energiájával a nukleoszómákat atrendező NURF működése szükséges. Adataink így a kromatin szerkezet kialakításában fontos szerepet játszó fehérje komplexek koordinált együtműködését bizonyítják. | The results of this project demonstrate the roles of different histone acetyltransferase complexes in the regulation of gene expression and chromatin structure and the interplay of different histone modifying and nucleosome remodeling complexes. We showed that in Drosophila melanogaster two related ADA2 proteins participate in the SAGA and ATAC GCN5-containing histone acetyltransferase complexes which have distinct specificity for different histone tails. The dADA2b-containing dSAGA complex is involved in histone H3 lysine 9 and lysine 14 acetylation, while the dADA2a-containing ATAC complex modifies histone H4 lysine 5 and lysine 12. Both of these complexes harbor the ADA3 factor which we have also identified and characterized. The loss of function of these complexes results in changes both in global gene expression and on the transcription of specific genes. The reduced level of histone H4 lysine 12 acetylation by the ATAC histone acetyltransferase complex also leads to chromatin structural changes by decreasing the phosphorylation level of histone H3 serine 10 by the JIL-1 kinase. The acetylation of histone H4 is dependent on the function of NURF chromatin remodeling complex which activity provides access ATAC to the chromatin. Altogether these data demonstrate an interdependence and delicate balance among the action of chromatin remodeling and modifying complexes in regulating chromatin organization and function

Evolutionary mode for the functional preservation of fast-evolving Drosophila telomere capping proteins

DNA end protection is fundamental for the long-term preservation of the genome. In vertebrates the Shelterin protein complex protects telomeric DNA ends, thereby contributing to the maintenance of genome integrity. In the Drosophila genus, this function is thought to be performed by the Terminin complex, an assembly of fast-evolving subunits. Considering that DNA end protection is fundamental for successful genome replication, the accelerated evolution of Terminin subunits is counterintuitive, as conservation is supposed to maintain the assembly and concerted function of the interacting partners. This problem extends over Drosophila telomere biology and provides insight into the evolution of protein assemblies. In order to learn more about the mechanistic details of this phenomenon we have investigated the intra- and interspecies assemblies of Verrocchio and Modigliani, two Terminin subunits using in vitro assays. Based on our results and on homology-based three-dimensional models for Ver and Moi, we conclude that both proteins contain Ob-fold and contribute to the ssDNA binding of the Terminin complex. We propose that the preservation of Ver function is achieved by conservation of specific amino acids responsible for folding or localized in interacting surfaces. We also provide here the first evidence on Moi DNA binding

Beyond initiation: Human P53 plays role in transcription elongation

The P53 tumor suppressor regulates the transcrip-tion initiation of selected genes by binding to specif-ic DNA sequences at their promoters. Here we report a novel role of P53 in transcription elongation in human cells. Upon transcription elongation block-age P53 is associated with genes, which have not been reported earlier as its direct targets. P53 could be co-immunoprecipitated with active forms of RPB1, highlighting its association with the elongat-ing RNAPII. During normal transcription cycle, P53 and RPB1 localized at distinct regions of selected non-canonical P53-target genes and this pattern of localization was changed upon transcription elonga-tion block. Additionally, transcription elongation block induced the ubiquitylation and the proteo-somal degradation of RPB1. Finally, we showed that the transcription block induced RPB1 degradation is mediated by P53. Our results reveal a novel role of P53 in human cells during transcription elongation blockage that might serve to facilitate the removal of RNAPII from DNA

Functional characterization and gene expression profiling of Drosophila melanogaster short dADA2b isoform-containing dSAGA complexes

The data presented here are in accord with results of genetic complementation experiments, and support the hypothesis that different isoforms of dADA2b contribute to the functional variations of dSAGA multiprotein HAT complexes