THERMAL AND CHEMICAL UNFOLDING OF 5’-DEOXY-5’- METHYLTHIOADENOSINE PHOSPHORYLASE FROM THE HYPERTHERMOPHILIC ARCHAEON SULFOLOBUS SOLFATARICUS

""5’-Deoxy-5’-methylthioadenosine phosphorylase II from Sulfolobus solfataricus (SsMTAPII) is a hyperthermophilic and hyperthermostable enzyme belonging to purine nucleoside phosporylases, ubiquitous enzymes that function in the purine salvage pathway. SsMTAPII is a tightly packed hexameric protein organized as a dimer-of-trimers with one active site per monomer. Each subunit is stabilized by two pairs of intrasubunit disulfide bridges and contains in its C-terminal region a CXC motif as a typical feature. To get information on the role played by disulfide bonds in stability and folding, the conformational stability of SsMTAPII and C262S and C259S\\\/C261S mutants was studied by thermal and guanidinium chloride-induced unfolding and analyzed by fluorescence spectroscopy, circular dichroism and SDS-PAGE. No thermal unfolding transition of SsMTAPII can be obtained under nonreducing conditions, while in the presence of reducing agents a Tm of 100°C can be measured demonstrating the involvement of disulfide bridges in enzyme thermostability. Differently from the wild-type, C262S and C259S\\\/C261S show complete thermal denaturation curves with sigmoidal transitions centered at 102°C and 99°C respectively. Under reducing conditions these values decrease by 4°C and 8°C respectively, highlighting the important role exerted by CXC disulfide on enzyme thermostability. Chemical and thermal unfolding of SsMTAPII are irreversible processes. Nevertheless, under reducing conditions we were able to highlight the reversible dissociation of the hexamer to monomers and to detect the reversibly unfolded species by SDS-PAGE. These results provide convincing evidence that disulfide bonds play a key role in the conformational stability of SsMTAPII. In fact, the removal of these covalent links weakening the highly compact structure of the enzyme allows the reversible transition from the native to the denatured state before covalent modifications, induced by high temperatures and chemical denaturants, may cause the irreversible protein degradation. This is the first report on the reversible unfolding of a hyperthermophilic oligomeric protein with disulfide bonds."

AZIONE PROTETTIVA DI ESTRATTI POLIFENOLICI DI MELA “ANNURCA” SU ERITROCITI UMANI SOTTOPOSTI A STRESS OSSIDATIVO

"La mela “Annurca”, un prodotto ortofrutticolo presente in Campania da almeno due millenni, oltre alle evidenti e peculiari caratteristiche organolettiche che contribuiscono fortemente a tracciarne ed indicarne la tipicità, contiene una grande quantità di sostanze fitochimiche che esplicano effetti benefici sulla salute. Studi biochimici ed epidemiologici suggeriscono che la presenza costante e regolare nella dieta della mela Annurca e di prodotti ad essa correlati possa ridurre il rischio di malattie croniche e degenerative attraverso una serie di meccanismi che comprendono effetti antiossidanti, antiproliferativi e di modulazione dei processi di trasduzione del segnale (1). Gran parte di questi effetti vengono ascritti alla componente polifenolica di cui la mela è particolarmente ricca. I polifenoli sono una classe eterogenea di composti ampiamente diffusi nel mondo vegetale e rappresentano una delle maggiori classi di antiossidanti della dieta. L’abbondanza di polifenoli nella mela, dove essi rappresentano circa il 22% della quantità totale di polifenoli della dieta, conferisce a questo alimento uno spiccato potere antiossidante che potrebbe giocare un ruolo importante nella prevenzione di patologie associate alla produzione di radicali liberi (2).. In questo lavoro è stato studiato l’effetto protettivo esercitato da estratti polifenolici della mela Annurca su eritrociti umani sottoposti a stress ossidativo. Inizialmente è stato dosato il contenuto in polifenoli di estratti metanolici ottenuti da campioni di mela Annurca e ne è stata valutata la capacità antiossidante mediante test spettrofotometrico che prevede l’utilizzo del radicale 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH*). E’ stato poi analizzato il potere antiossidante degli estratti polifenolici nei confronti di danni cellulari indotti da radicali liberi. Eritrociti umani sono stati preincubati con differenti concentrazioni di polifenoli e poi incubati per 1 ora in presenza di terz-butil-idroperossido (t-BHP) 500 M. Il danno cellulare indotto dallo stress ossidativo è stato valutato mediante il metodo TBARS, che misura la formazione delle specie reattive all’acido tiobarbiturico, come la malondialdeide, uno dei principali prodotti della perossidazione lipidica a carico degli acidi grassi insaturi di membrana. . I risultati ottenuti indicano che gli estratti polifenolici della mela Annurca sono in grado di proteggere l’eritrocita dallo stress ossidativo contrastando, mediante una significativa azione antiossidante, la formazione di specie reattive responsabili dei danni cellulari. L’effetto antiossidante è evidenziabile già a concentrazioni 10 M ed è direttamente proporzionale alla concentrazione dei composti polifenolici nei campioni analizzati..

INSIGHTS INTO STRUCTURAL STABILITY DETERMINANTS OF NUCLEOSIDE HYDROLASES

"Thermophilic enzymes face the challenge of maintaining optimal catalytic activity at temperatures nearing the boiling point of water, hence, they can be used as interesting model systems to understand the evolution of enzymes, as well as the molecular strategies developed as defence against thermal denaturation. Several comparisons between the structures of homologous isozymes from mesophilic and thermophilic organisms highlighted specific properties of folded proteins that may contribute to thermal stability. Moreover, the understanding of general strategies that may enhance the stability of enzymes at high temperatures could be beneficial for the engineering of biocatalysts in industrial processes. . Here we report a comparative structure-thermostability analysis of a panel of tetrameric nucleoside hydrolase (NH) enzymes from mesophiles and thermophiles by a combined structural and spectroscopic characterization that utilize principal component analysis (PCA) and differential scanning fluorimetry (DSF). . The availability of high-resolution structures of NH enzymes isolated from both mesophilic and hyperthermophilic organisms belonging to the same structural homology group, emphasizes the elements that lead to enhanced stability and underscores that resistance to thermal denaturation can be achieved using a combination of different structural solutions. Apparently, each organism can employ a different combination of stabilizing structural features to achieve the required level of NH stability. However, the multivariate analysis highlights how the NHs from mesophilic and thermophilic organisms here considered can be clustered according to the type and extent of specific features used for optimization. The results obtained indicate that the inclusion of salt bridges at the intersubunit contact surfaces is the only shared strategy in both mesophilic and thermophilic organisms to modulate the stability of NHs..