Fejlődési stádiumtól függően expresszálódó gének izolálása és jellemzése mikotoxin termelő Gibberella fujikuroi törzsekben = Isolation and characterisation of developmentally regulated genes from mycotoxin producing Gibberella fujikuroi isolates

Munkánk elsődleges célja fejlődésspecifikus gének izolálása és jellemzése volt F. proliferatum törzsben. A cDNS-AFLP módszert alkalmaztuk és a kapott 310 differenciáló fragmentumból hét mutatott szignifikánsan eltérő expressziót a fiatal és az idős tenyészet között. Génbanki adatok alapján megállapítottuk, hogy az egyik klón neutrális aminosav transzportert kódoló fehérjékkel mutatnak nagy hasonlóságot. A Fpmtr-nek nevezett gén teljes kópiáját izoláltuk, mely egy kópiában van jelen és 462 aminósavat kódol. A gén funkciójának megismeréséhez ∆Fpmtr mutánsokat hoztunk létre irányított génrontással. A transzformánsok hím-fertilitása nem változott, női fertilitásuk azonban jelentősen gyengült. A vad típusú, ITEM 2287 törzs vegetatíve ön-inkompatibilis, azaz komplementer, nitrátot nem hasznosító mutánsai (nit1, nitM és nit3) nem hoznak létre életképes heterokarióta sejteket. A ∆Fpmtr nit-mutánsai azonban képesek voltak komplementálni a vad típusú törzs megfelelő auxotróf mutánsait, azaz ennek az érdekes és szokatlan aminosav transzporter génnek az inaktiválásával sikerült megszüntetni a vegetatív ön-inkompatibilitást. Mindezek arra utalnak, hogy a F. proliferatum Fpmtr génje mind a szexuális, mind a paraszexuális folyamatokban kitüntetett szerepet játszik, és az FpMtr géntermék nem tipikus aminosav transzporter, hanem inkább szenzor/receptor funkciót ellátó fehérje. | To identify growth stage specific genes in F. proliferatum a comparative analysis of gene expression was performed by cDNA-AFLP. Altogether 310 fragments showed strikingly different intensities depending on growth stage. One of these fragments, which was strongly expressed in the early stage of conidial germination and repressed in the late stationary phase, gave significant sequence homology to a neutral aromatic and aliphatic amino acid transporter gene. We isolated the Fpmtr from the genomic library of F. proliferatum. Fpmtr is a single copy gene and encodes a polypeptide containing 462 amino acids. To find the specific function of Fpmtr, a transformation vector was constructed by using the hygromicin B phosphotransferase gene (hph). Male fertility of the ΔFpmtr mutants was not affected, however their female fertility became strongly retarded. Strain ITEM 2287 is a vegetatively self-incompatible strain, i.e. complementary nitrate non-utilizing mutants (nit1, nitM and nit3) of this fungus are unable to form viable heterokaryons. Our data suggest that Fpmtr is involved in multiple developmental processes related to both sexual and parasexual recombination events in F. proliferatum and FpMtr functions as a sensor/receptor protein rather than a typical amino acid transporter

Reprodukciós stratégiák a Gibberella fujikuroiban = Reproduction strategies of Gibberella fujikuroi

Az ivarosan szaporodó Gibberella/Fusarium-fajokban MAT gének ellenőrzik a párosodást, de a nemzetség "aszexuális" tagjainak is vannak működőképes, konstitutívan átíródó párosodási típus génjeik. A MAT gének transzkripciós faktorokat kódolnak, amelyek az ivaros szaporodás szabályozásán kívül más génekre is hatással lehetnek. Amikor összehasonlítottuk a F. verticillioides DeltaFvMAT1-2-1 mutánsának transzkripciós profilját a vad típusú szülőtörzsével, több mint 200 olyan EST szekvenciát azonosítottunk, amelyek vagy alul- vagy felül-regulálódtak a mutánsban. A mutánsban felül-regulálódott EST-ek között gyakran fordultak elő a fehérjeszintézisben és az anyagcserében résztvevő fehérjéket kódoló szekvenciák, míg az alul-regulálódott EST-ek között többségben voltak a jelátvitelben, és a sejtek közötti kommunikációban érintett szekvenciák. A csökkent fertilitás valószínűleg több olyan gén mutációjával magyarázható, mely mutációk női sterilitást okoznak. Vizsgáltuk a F. proliferatum több gén-diszrupciós mutánsának párosodási képességét. Az Fpac1, az Fpmtr1 és az Fpnitr1 nyilvánvalóan eltérő szintézis utakban dolgozó fehérjéket kódolnak, mégis, mindhárom gén inaktiválása csökkentette a női fertilitást. Számos olyan gén van tehát, amelynek nincs közvetlen kapcsolata a párosodással, de mégis befolyásolni képes az ivaros szaporodás gyakoriságát, ami arra utal, hogy ez a folyamat több, a női fertilitással/sterilitással közvetlenül nem összefüggő faktor egybehangolt működését igényli. | Fusarium species, which have a well documented sexual stage mate in either a homothallic or heterothallic manner, but a great number of species have no known sexual stage. Mating in sexually reproducing species is controlled by MAT genes, but "asexual" members of the genus also have functional, constitutively transcribed mating type genes. The MAT1-1-1 and MAT1-2-1 encode transcription factors which, besides controlling sexual reproduction, may affect other genes not involved directly in the mating process. By comparing the transcript profiles of a DeltaFvMAT1-2-1 knock out mutant and the wild type of F. verticillioides more than 200 ESTs, either down- or up-regulated in the mutant were identified. Sequences, encoding proteins involved in protein synthesis and metabolism occurred more frequently among ESTs up-regulated in the mutant, while sequences involved in cell signaling were more frequent in the down-regulated subset of ESTs. The lack of fertility in fungi are probably due to changes in one or more of numerous genes that cause female sterility. A number of gene disruption mutants of F. proliferatum were assessed for their mating capabilities. Fpac1, Fpmtr1, and Fpnitr1 encode proteins in seemingly un-related pathways, but mutations at any of these loci can reduce female fertility. Thus, a number of genes can influence the frequency of sexual reproduction indicating that this process requires the concerted operation of many factors not obviously connected to female sterility

Cloning and Heterologous Expression of a β-d-Mannosidase (EC 3.2.1.25)-Encoding Gene from Thermobifida fusca TM51

Thermobifida fusca TM51, a thermophilic actinomycete isolated from composted horse manure, was found to produce a number of lignocellulose-degrading hydrolases, including endoglucanases, exoglucanases, endoxylanases, β-xylosidases, endomannanases, and β-mannosidases, when grown on cellulose or hemicellulose as carbon sources. β-Mannosidases (EC 3.2.1.25), although contributing to the hydrolysis of hemicellulose fractions, such as galacto-mannans, constitute a lesser-known group of the lytic enzyme systems due to their low representation in the proteins secreted by hemicellulolytic microorganisms. An expression library of T. fusca, prepared in Streptomyces lividans TK24, was screened for β-mannosidase activity to clone genes coding for mannosidases. One positive clone was identified, and a β-mannosidase-encoding gene (manB) was isolated. Sequence analysis of the deduced amino acid sequence of the putative ManB protein revealed substantial similarity to known mannosidases in family 2 of the glycosyl hydrolase enzymes. The calculated molecular mass of the predicted protein was 94 kDa, with an estimated pI of 4.87. S. lividans was used as heterologous expression host for the putative β-mannosidase gene of T. fusca. The purified gene product obtained from the culture filtrate of S. lividans was then subjected to more-detailed biochemical analysis. Temperature and pH optima of the recombinant enzyme were 53°C and 7.17, respectively. Substrate specificity tests revealed that the enzyme exerts only β-d-mannosidase activity. Its kinetic parameters, determined on para-nitrophenyl β-d-mannopyranoside (pNP-βM) substrate were as follows: K(m) = 180 μM and V(max) = 5.96 μmol min(−1) mg(−1); the inhibition constant for mannose was K(i) = 5.5 mM. Glucono-lacton had no effect on the enzyme activity. A moderate trans-glycosidase activity was also observed when the enzyme was incubated in the presence of pNP-αM and pNP-βM; under these conditions mannosyl groups were transferred by the enzyme from pNP-βM to pNP-αM resulting in the synthesis of small amounts (1 to 2%) of disaccharides