"Candida albicans" proteome dynamics upon macrophage interaction and exposure to stress inducers

Tesis inédita de la Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Farmacia, Departamento de Microbiología y Parasitología, leída el 15/11/2019Depto. de Microbiología y ParasitologíaFac. de FarmaciaTRUEunpu

The external face of Candida albicans: A proteomic view of the cell surface and the extracellular environment.

The cell surface and secreted proteins are the initial points of contact between Candida albicans and the host. Improvements in protein extraction approaches and mass spectrometers have allowed researchers to obtain a comprehensive knowledge of these external subproteomes. In this paper, we review the published proteomic studies that have examined C. albicans extracellular proteins, including the cell surface proteins or surfome and the secreted proteins or secretome. The use of different approaches to isolate cell wall and cell surface proteins, such as fractionation approaches or cell shaving, have resulted in different outcomes. Proteins with N-terminal signal peptide, known as classically secreted proteins, and those that lack the signal peptide, known as unconventionally secreted proteins, have been consistently identified. Existing studies on C. albicans extracellular vesicles reveal that they are relevant as an unconventional pathway of protein secretion and can help explain the presence of proteins without a signal peptide, including some moonlighting proteins, in the cell wall and the extracellular environment. According to the global view presented in this review, cell wall proteins, virulence factors such as adhesins or hydrolytic enzymes, metabolic enzymes and stress related-proteins are important groups of proteins in C. albicans surfome and secretome. BIOLOGICAL SIGNIFICANCE Candida albicans extracellular proteins are involved in biofilm formation, cell nutrient acquisition and cell wall integrity maintenance. Furthermore, these proteins include virulence factors and immunogenic proteins. This review is of outstanding interest, not only because it extends knowledge of the C. albicans surface and extracellular proteins that could be related with pathogenesis, but also because it presents insights that may facilitate the future development of new antifungal drugs and vaccines and contributes to efforts to identify new biomarkers that can be employed to diagnose candidiasis. Here, we list more than 570 C. albicans proteins that have been identified in extracellular locations to deliver the most extensive catalogue of this type of proteins to date. Moreover, we describe 16 proteins detected at all locations analysed in the works revised. These proteins include the glycophosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins Ecm33, Pga4 and Phr2 and unconventional secretory proteins such as Eft2, Eno1, Hsp70, Pdc11, Pgk1 and Tdh3. Furthermore, 13 of these 16 proteins are immunogenic and could represent a set of interesting candidates for biomarker discovery

Diseño, desarrollo y elaboración de un soporte informático interactivo para el estudio de las prácticas de la asignatura de Microbiología Clínica mediante el uso de imágenes reales de pruebas microbiológicas obtenidas en el laboratorio

En las diferentes clases prácticas relacionadas con asignaturas de Microbiología, como sucede en otras áreas de conocimiento, un aspecto que requiere especial atención es el diseño y la elaboración de herramientas que contribuyan a facilitar y mejorar el aprendizaje por parte del alumnado de los múltiples conceptos microbiológicos que se imparten en las mismas, facilitando en lo posible la enseñanza no presencial. En este sentido, pensamos que la existencia de un soporte virtual interactivo de los distintos abordajes prácticos realizados en el laboratorio y sus posibles resultados facilitaría en gran medida el estudio, y por tanto, la adquisición de las competencias correspondientes a la docencia práctica de Microbiología. En los dos cursos académicos anteriores (2017/18 y 2018/19), a través de sendos proyectos UCM-INNOVA (Proyectos 161 y 76, respectivamente), se ha recopilado, con la participación activa de los alumnos, una gran cantidad de información gráfica de toda la labor práctica realizada durante la impartición de las asignaturas incluidas en diversas titulaciones, habiéndose generado de esta manera un amplio banco de imágenes de calidad para diversos usos docentes. El proyecto realizado (UCM-INNOVA 19/20 Proyecto 11), ha consistido en el diseño, generación e implementación de una herramienta informática en entorno PowerPoint, a la que hemos denominado EMC (Evaluación Microbiología Clínica), que pone en valor todo el esfuerzo realizado por parte del profesorado y los alumnos en los proyectos anteriores, en relación a la asignatura de Microbiología Clínica del 4º curso del Grado en Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid. En la aplicación EMC se ha incluido y estructurado cada práctica concreta siguiendo la misma organización realizada en el laboratorio, donde se sigue una rutina secuencial y jerárquica en la que el alumno debe interpretar los resultados posibles, fundamentalmente presentados en formato gráfico, de cada una de las pruebas realizadas según el tipo/s de microorganismo/s implicados, siendo redirigido a otro panel de pruebas cada vez más específicas hasta completar cada una de las prácticas. Esta herramienta se ha mostrado útil, no sólo para facilitar el estudio y el aprendizaje de los contenidos temáticos prácticos, sino también para servir de soporte y complemento al estudio del programa teórico de la asignatura. Es importante destacar que, durante las prácticas de Microbiología Clínica se explican los síndromes clínicos relacionados con las enfermedades infecciosas más frecuentes y su diagnóstico microbiológico, incluyendo desde la obtención y procesamiento de las muestras biológicas problema, hasta su posterior análisis microbiológico diferencial con el objeto de identificar a los potenciales microorganismos patógenos responsables de cada cuadro. Tras la realización de cada práctica, las pruebas microbiológicas deben ser adecuadamente eliminadas, no pudiendo guardarse las pruebas de forma indefinida. Por lo tanto, poder revisitar cuantas veces sea necesario por el alumno todas las pruebas y sus correspondientes resultados e interpretación de forma sencilla y visual en un entorno amigable (tipo presentación PowerPoint), supone un apoyo al estudio y al aprendizaje. Finalmente, pensamos que es importante remarcar que incluso en Universidades donde la metodología docente es eminentemente presencial, el desarrollo y utilización de forma complementaria de herramientas que faciliten el aprendizaje on-line es crucial en los tiempos que vivimos, cómo ha dejado patente la pandemia de la COVID-19

The Combination of Iron and Copper Increases Pathogenicity and Induces Proteins Related to the Main Virulence Factors in Clinical Isolates of Cryptococcus neoformans var. grubii

In fungi, metals are associated with the expression of virulence factors. However, it is unclear whether the uptake of metals affects their pathogenicity. This study aimed to evaluate the effect of iron/copper in modulating pathogenicity and proteomic response in two clinical isolates of C. neoformans with high and low pathogenicity. Methods: In both isolates, the effect of 50 µM iron and 500 µM copper on pathogenicity, capsule induction, and melanin production was evaluated. We then performed a quantitative proteomic analysis of cytoplasmic extracts exposed to that combination. Finally, the effect on pathogenicity by iron and copper was evaluated in eight additional isolates. Results: In both isolates, the combination of iron and copper increased pathogenicity, capsule size, and melanin production. Regarding proteomic data, proteins with increased levels after iron and copper exposure were related to biological processes such as cell stress, vesicular traffic (Ap1, Vps35), cell wall structure (Och1, Ccr4, Gsk3), melanin biosynthesis (Hem15, Mln2), DNA repair (Chk1), protein transport (Mms2), SUMOylation (Uba2), and mitochondrial transport (Atm1). Increased pathogenicity by exposure to metal combination was also confirmed in 90% of the eight isolates. Conclusions: The combination of these metals enhances pathogenicity and increases the abundance of proteins related to the main virulence factors

Elaboración de informes virtuales de prácticas de Microbiología general, odontológica e industrial basados en fotografías y su integración en un banco común de imágenes de Microbiología

Este proyecto, que se platea como continuación del número 161 del curso 2016-2017, propone la creación y realización de informes de prácticas virtuales en distintas asignaturas del área de la Microbiología. Con ello, se pretende incentivar el estudio y mejorar el aprovechamiento de las prácticas realizadas por alumnos de distintos cursos, Grados y Facultades, mediante el uso de las nuevas tecnologías y metodologías más visuales. Dichas asignaturas son: • Microbiología e Inmunología, 2º curso Grado de Odontología, Facultad de Odontología. • Microbiología, 3º curso Grado en Farmacia, Facultad de Farmacia. • Microbiología Industrial y biotecnología (MIBT), 2º curso Grado en Ciencia y Tecnología de los alimentos (CYTA), Facultad de Veterinaria. Se han construido 4 espacios virtuales con plantillas de los informes de prácticas, ya que el proyecto se realizó en 4 grupos distintos. De esta forma se tendrían guías virtuales de las distintas asignaturas con la inclusión de las fotografías y su interpretación. También se comprobaría la utilidad de esta metodología según la estructura de las prácticas de las asignaturas y/o la idiosincrasia de los distintos grupos de alumnos. El otro objetivo general del proyecto es el almacenamiento y clasificación de las fotografías realizadas para ampliar el banco de fotografías de microorganismos y pruebas microbiológicas. Esto, también justifica la elección de las 3 asignaturas mencionadas. El proyecto se ha desarrollado según lo previsto y se han alcanzado de manera satisfactoria los objetivos propuestos. Además, aunque de forma desigual según las asignaturas, la realización de este proyecto ha resultado de interés para los estudiantes, repercutiendo de forma positiva en algunas calificaciones y no representando una carga de trabajo adicional excesiva. Para los profesores y otros miembros del equipo del proyecto también ha supuesto una experiencia gratificante y el material generado puede ahora tener múltiples aplicaciones docentes. Por lo tanto, está metodología se podrá seguir utilizando si los profesores así lo desean en las prácticas de las asignaturas en las que haya presentado mayor utilidad.Depto. de Microbiología y ParasitologíaFac. de FarmaciaFALSEsubmitte

Extending the Proteomic Characterization of Candida albicans Exposed to Stress and Apoptotic Inducers through Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry

Candida albicans is a commensal fungus that causes systemic infections in immunosuppressed patients. In order to deal with the changing environment during commensalism or infection, C. albicans must reprogram its proteome. Characterizing the stress-induced changes in the proteome that C. albicans uses to survive should be very useful in the development of new antifungal drugs. We studied the C. albicans global proteome after exposure to hydrogen peroxide (H2O2) and acetic acid (AA), using a data-independent acquisition mass spectrometry (DIA-MS) strategy. More than 2,000 C. albicans proteins were quantified using an ion library previously constructed using data-dependent acquisition mass spectrometry (DDA-MS). C. albicans responded to treatment with H2O2 with an increase in the abundance of many proteins involved in the oxidative stress response, protein folding, and proteasome-dependent catabolism, which led to increased proteasome activity. The data revealed a previously unknown key role for Prn1, a protein similar to pirins, in the oxidative stress response. Treatment with AA resulted in a general decrease in the abundance of proteins involved in amino acid biosynthesis, protein folding, and rRNA processing. Almost all proteasome proteins declined, as did proteasome activity. Apoptosis was observed after treatment with H2O2 but not AA. A targeted proteomic study of 32 proteins related to apoptosis in yeast supported the results obtained by DIA-MS and allowed the creation of an efficient method to quantify relevant proteins after treatment with stressors (H2O2, AA, and amphotericin B). This approach also uncovered a main role for Oye32, an oxidoreductase, suggesting this protein as a possible apoptotic marker common to many stressors. IMPORTANCE Fungal infections are a worldwide health problem, especially in immunocompromised patients and patients with chronic disorders. Invasive candidiasis, caused mainly by C. albicans, is among the most common fungal diseases. Despite the existence of treatments to combat candidiasis, the spectrum of drugs available is limited. For the discovery of new drug targets, it is essential to know the pathogen response to different stress conditions. Our study provides a global vision of proteomic remodeling in C. albicans after exposure to different agents, such as hydrogen peroxide, acetic acid, and amphotericin B, that can cause apoptotic cell death. These results revealed the significance of many proteins related to oxidative stress response and proteasome activity, among others. Of note, the discovery of Prn1 as a key protein in the defense against oxidative stress as well the increase in the abundance of Oye32 protein when apoptotic process occurred point them out as possible drug targets