Evidence for different binding sites on the 33-kDa protein for DCMU, atrazine and QB

AbstractTwo DCMU-resistant strains of the cyanobacterium Synechocystis 6714 were used to analyse the binding sites of DCMU, atrazine and QB. DCMUr-IIA was DCMU and atrazine resistant; it presented an impaired electron flow and its 33-kDa protein was weakly attached to the membrane. DCMUr-IIB, derived from the former, simultaneously regained atrazine sensitivity, normal electron flow and a tight linkage of the 33-kDa protein to the membrane. This mutant shows that loss of DCMU binding does not necessarily affect the binding of either atrazine or QB. The role of the 33-kDa protein is discussed

Roger Munier et la "topologie de l'être"

Roger Munier, traducteur et ami de Heidegger, est l'auteur d'une poésie méditative. L'objet de la thèse est de se demander si son oeuvre peut être considérée comme une "topologie de l'être" dans la mesure où, dans L'Expérience de la pensée, Heidegger a déclaré : "La poésie pensante est en vérité la topologie de l'être". Il semble que Roger Munier soit plus proche de l'Ouvert rilkéen que de l'ouverture de l'être heideggerienne et que la "topologie" dont parle Heidegger soit un cadre trop étroit pour l'écrivain français. De plus, celui-ci préfère le fragment au poème et n'attribue donc pas au poème le privilège de la " poésie pensante ". Roger Munier reste cependant proche de Heidegger et de la phénoménologie dans sa volonté d'accéder "aux choses mêmes". Cette attention aux choses nécessite une poésie épiphanique tournée vers le sensible et soucieuse de traduire la présence. Mais l'herméneutique subvertit la démarche phénoménologique et les descriptions poétiques de Roger Munier ne sont qu'en apparence proches de celles de Husserl et de Heidegger. A partir de Mélancolie (1987), c'est le mystère du dehors pur, et non plus véritablement le sensible, qui retient l'attention de l'écrivain. En effet, son écriture poétique est plutôt au service de l'expérience mystique que de la pensée. Marqué par ses lectures de Maître Eckhart et sa traduction de Silesius, Roger Munier se tourne vers la voie négative. Sa "topologie" est ainsi davantage une topologie du Rien qu'une " topologie de l'être ". Cette oeuvre placée dans l'héritage de Heidegger et du Romantisme allemand relève donc de la poésie épiphanique mais doit être située sur un plan européen et non pas dans le cadre trop restreint de la poésie française. Son originalité réside dans la conjonction d'une poésie de la présence hors du poème et d'une herméneutique négative. Pour Roger Munier, la poésie n'est pas une fin en soi, mais l'instrument de la topologie du Rien qu'il s'agit d'élaborer.Roger Munier, translator and friend of Heidegger, is the author of a meditative poetry. The object of the thesis is to ask if his work can be consider as a "topology of the being" whereas in The Experience of the thinking Heidegger has declared : "The thinking poetry is truly the topology of the being". It seams that Roger Munier is closer to the Open of Rilke than to the opening of the being of Heidegger, and that the "topology" which Heidegger is speaking about is a too narrow frame for the French author. Moreover, he prefers the fragment to the poem and does not award the poem the privilege of the "thinking poetry". Roger Munier stays however close to Heidegger and to the phenomenology because his will to access to the "things themselves". This attention to the things needs an epiphanical poetry turned towards the sensible and concerned with the translation of the presence. But the hermeneutism subverts the phenomenological method and the poetical descriptions of Roger Munier are only apparently close to those of Husserl and Heidegger. From Melancholy (1987), it is the mystery of the pure outside, and not yet the sensible in itself, that keeps the attention of the author. Indeed, his poetical writing is rather in service of the mystical experience than of the thinking. Impressed by his readings of Master Eckhart and his translation of Silesius, Roger Munier turns himself towards the negative way. So his "topology" is rather a topology of the nothingness than a "topology of the being". This work, which is located in the heritage of Heidegger and German Romanticism, therefore belongs to epiphanical poetry but has to be settled at European range and not inside the too narrow perspective of the French poetry. His originality consists in the union of a poetry of the presence outside the poem and of negative hermeneutism. For Roger Munier, poetry is not a purpose in itself but the means of the topology of the nothingness which is to be achieved.NANTERRE-BU PARIS10 (920502102) / SudocSudocFranceF

Adaptation de Rubrivivax gelatinosus à la présence de l'oxygène (étude des différents mécanismes via l'expression de l'antenne LH2)

Nous nous sommes intéressés aux mécanismes d adaptation que possèdent la bactérie pourpre Rubrivivax gelatinosus pour maintenir en présence d oxygène la synthèse des complexes photosynthétiques et plus particulièrement celle de l antenne LH2. Les gènes pucBA (codant les protéines de LH2) codent deux transcrits, formés à partir du même promoteur et de deux terminateurs. Leur production est pratiquement identique en photosynthèse et en semi aérobie. En amont des gènes pucBA, est présent un site de fixation pour le facteur PpsR, identifié chez Rhodobacter comme étant une répresseur transcriptionnel des gènes photosynthétiques et notamment des gènes puc, en présence d oxygène. Nous nous sommes alors intéressés à la régulation des gènes puc et du gène crtI par le facteur PpsR. Cette étude a permis d identifier en semi aérobie un rôle activateur de PpsR sur l expression des gènes puc et un rôle de répresseur sur crtI. Le maintien de la synthèse des protéines structurales en présence d oxygène n est pas suffisant pour expliquer la formation du complexe LH2, il est nécessaire que les bactériochlorophylles soient également produites. Nous avons également identifié une stratégie qu utilise la bactérie pour maintenir la voie de biosynthèse des bactériochlorophylles, quelques soient les conditions d oxygénation. Cette stratégie s effectue via un mécanisme à deux enzymes, BchE et AcsF. BchE est active en anaérobie et en faible oxygénation, AcsF est active en forte oxygénation. La capacité de maintenir la synthèse des bactériochlorophylles en présence d oxygène permet à la bactérie de produire rapidement les photosystèmes lors des transitions aérobes-anaérobes.We have studied the adaptation mechanisms developed by the purple bacterium Rubrivivax gelatinosus to maintain the synthesis of the photosynthetic complexes in presence of oxygen; in particular the synthesis of the LH2 antenna complex. During this work, we have analysed the pucBA (encoding for the LH2 polypeptides) gene expression. We have identified two pucBA transcripts made from the same promoter and ending at two different terminators. The amount of the pucBA transcripts is the same between the semi aerobic and photosynthetic conditions. The role of PpsR, a putative transcription factor that regulates the pucBA expression was studied. In Rhodobacter, this factor was identified as a repressor of the puc genes under aerobic condition. We have analysed the puc and crtI genes regulation by PpsR under semi aerobic conditions. This work has shown an activator role of PpsR on pucBA genes expression and a repressor role on crtI gene. The presence of the structural protein under aerobic condition is not sufficient to explain the presence of the LH2 complex; the bacteriochlorophyll should also be synthesized. It was shown that the bacterium maintains the bacteriochlorophyll synthesis under different aerobic conditions by using two different enzymes, BchE and AcsF. We have shown that BchE is active under anaerobic or low oxygenation, while AcsF is active only under high oxygenation. We have suggested that the availability of bacteriochlorophylls under aerobic condition is a significant advantage to rapidly build up the photosystem, during the transition from aerobic to anaerobic conditions.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

L'homéostasie du cuivre chez la protéobactérie Rubrivivax gelatinosus

L adaptabilité des cellules aux changements environnementaux repose sur leur capacité à mettre en place des complexes enzymatiques qui régulent leurs différentes voies métaboliques. Ces complexes protéiques nécessitent des cofacteurs (hème et métaux) comme le cuivre. En effet, le cuivre est un oligoélément essentiel pour la survie des organismes vivants, il est notamment présent dans des complexes tels que la cytochrome c oxydase de la chaine respiratoire aérobie. Cependant, l excès de Cu est aussi néfaste pour la cellule. Il génère du stress oxydatif responsable de divers dommages cellulaires. Il est donc nécessaire aux cellules de contrôler la prise en charge du cuivre afin d assurer la régulation de sa concentration intracellulaire. Dans ce travail, nous avons étudié le système de tolérance au cuivre chez Rubrivivax gelatinosus. J ai identifié plusieurs gènes impliqués dans ce système, un de ces gènes code pour un transporteur de cuivre CopA (homologue aux ATP7A/ATP7B de l homme). Les autres gènes codent pour : un régulateur de ce système sensible aux variations du cuivre CopR et deux protéines solubles (CopI et CopJ) fortement induites dans des conditions d excès de cuivre. J ai également montré que malgré l homologie de séquence entre les pompes à cuivre CopA et CtpA (identifiées auparavant au laboratoire) ; elles remplissent deux rôles physiologiques différents dans la cellule. CopA est vitale pour la tolérance au Cu alors que CtpA a un rôle dans l insertion du Cu au sein des cuproprotéines. Par ailleurs, j ai montré qu en absence de CopA, la toxicité du cuivre est plus importante dans les conditions de croissance en microaérobie ou en photosynthèse anaérobe. En effet, l excès du Cu affecte la voie de biosynthèse des porphyrines (hèmes et bactériochlorophylles) reflété par l accumulation d un intermédiaire de cette voie, la coproporphyrine III. Cette accumulation résulte de l effet de l excès du cuivre sur la coproporphyrine III oxydase (HemN) probablement en déstabilisant son cluster [4Fe-4S]. Ces résultats sont soutenus par le fait que l effet toxique du cuivre sur les tétrapyrolles n est pas observé à forte aération en raison de la substitution de HemN par une enzyme à centre bimétalliques HemF. Cette dernière tolère et utilise l oxygène, notre étude suggère qu elle tolère aussi le cuivre. Les résultats obtenus sur les cibles du cuivre en anaérobie au cours de cette étude ainsi que celle publiés par Macomber (Macomber and Imlay 2009), suggèrent que les métaux ont pu éventuellement jouer un rôle dans l émergence des enzymes à clusters bimétalliques lors du passage à une atmosphère oxygénique permettant une adaptation à l augmentation de la toxicité de certains métaux. L ensemble des résultats obtenus à partir de l analyse des différents mutants au cours de cette étude sur la tolérance au cuivre chez R. gelatinosus me permet de proposer un modèle d efflux du cuivre différent de celui d E. coli. Je propose d attribuer un rôle crucial aux protéines solubles CopI et CopJ qui fixeraient probablement le cuivre grâce aux nombreux résidus histidines et méthionines. Leurs rôles seraient soit de séquestrer le cuivre au niveau du périplasme, soit de l oxyder ou encore de l excréter vers un système d efflux de la membrane externe afin de le chasser de la cellule.The ability of Rubrivivax to adapt to its environment (aerobic versus anaerobic) relay on its ability to assemble different complexes involved respiration or photosynthesis pathways. These complexes require cofactors such as heme or chlorophylls, and metals such as magnesium, iron and copper. In particular, copper (Cu) is an essential trace element required for the assembly and the activity of the cytochrome c oxidase in the aerobic respiratory chain. Excess Cu however, is toxic and can originate in various cellular damages. In the absence of a tight control of copper entrance in the cells, bacteria have evolved different efflux systems to control copper concentration within the cytoplasm and the membrane. Very few data are available on the copper homeostasis systems in photosynthetic bacteria. We therefore studied the copper homeostasis system in Rubrivivax gelatinosus to understand how these microorganisms can deal with excess copper. In this work, I have identified several genes involved in copper tolerance. Central to this system, the P1B-type Cu -ATPase CopA plays a major role in copper tolerance and translocates copper from the cytoplasm to the periplasm. The outlet of copper in the periplasm varies depending on the species. Cu can be sequestrated, oxidized or released outside the cells. Here I describe the identification CopI, a periplasmic protein present in many proteobacteria including Pseudomonas and Cupriavidus and show its requirement for copper tolerance in Rubrivivax under both aerobic and anaerobic conditions. Expression of both CopA and CopI is induced under excess copper and is regulated by CopR, a MerR regulator sensitive to changes in copper concentration. Rubrivivax genome encodes two P1B-type Cu -ATPases, CopA and CtpA. My work confirmed that despite the sequence homology between these copper ATPases, they fulifill two different physiological roles in the cell. CopA is vital for tolerance to Cu while CtpA has a role in the insertion of Cu within cuproproteines. Furthermore, I showed that excess copper in the copA null mutant resulted in a substantial decrease of the cytochrome c oxidase and the photosystem under microaerobic and anaerobic conditions together with the extrusion of coproporphyrin III. Analyses of the mutant indicated that copper targeted the tetrapyrrole biosynthesis pathway at the level of the coproporphyrinogen III oxidase HemN and thereby affects the heme and chlorophyll containing complexes, the oxidase and the photosystem. These results, as well as published work by Macomber (Macomber and Imlay 2009) suggest that Cu target the 4Fe-4S clusters and that this metal may have played a role in the emergence of bimetallic enzymes to replace 4Fe-4S clusters during the appearance of oxygen in the atmosphere.Analyses of CopI expression and the copI null mutant, demonstrate that CopI is required for copper tolerance, and in the absence of an E. coli Cus-like copper efflux system in R. gelatinosus, my results strongly suggest that CopI is the major copper handling protein within the membrane. Altogether, my results allowed me to draw a comprehensive picture of the copper tolerance system within the purple photosynthetic bacterium Rubrivivax gelatinosus and probably other proteobacteria that possess a homologue of copI gene.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Natural Resistance to Inhibitors of the Ubiquinol Cytochrome c Oxidoreductase of Rubrivivax gelatinosus: Sequence and Functional Analysis of the Cytochrome bc(1) Complex

Biochemical analyses of Rubrivivax gelatinosus membranes have revealed that the cytochrome bc(1) complex is highly resistant to classical inhibitors including myxothiazol, stigmatellin, and antimycin. This is the first report of a strain exhibiting resistance to inhibitors of both catalytic Q(0) and Q(i) sites. Because the resistance to cytochrome bc(1) inhibitors is primarily related to the cytochrome b primary structure, the petABC operon encoding the subunits of the cytochrome bc(1) complex of Rubrivivax gelatinosus was sequenced. In addition to homologies to the corresponding proteins from other organisms, the deduced amino acid sequence of the cytochrome b polypeptide shows (i) an E303V substitution in the highly conserved PEWY loop involved in quinol/stigmatellin binding, (ii) other substitutions that could be involved in resistance to cytochrome bc(1) inhibitors, and (iii) 14 residues instead of 13 between the histidines in helix IV that likely serve as the second axial ligand to the b(H) and b(L) hemes, respectively. These characteristics imply different functional properties of the cytochrome bc(1) complex of this bacterium. The consequences of these structural features for the resistance to inhibitors and for the properties of R. gelatinosus cytochrome bc(1) are discussed with reference to the structure and function of the cytochrome bc(1) complexes from other organisms

Regulation of Photosynthesis Genes in Rubrivivax gelatinosus: Transcription Factor PpsR Is Involved in both Negative and Positive Control

Induction of biosynthesis of the photosystem in anoxygenic photosynthetic bacteria occurs when the oxygen concentration drops. Control of this induction takes place primarily at the transcriptional level, with photosynthesis genes expressed preferentially under anaerobic conditions. Here, we report analysis of the transcriptional control of two photosynthesis promoters, pucBA and crtI, by the PpsR factor in Rubrivivax gelatinosus. This was accomplished by analyzing the photosystem production in the wild type and in the PPSRK (ppsR::Km) mutant grown under anaerobic and semiaerobic conditions and by assessing the β-galactosidase activity of lacZ transcriptionally fused to promoters possessing the putative PpsR-binding consensus sequences. It was found that under semiaerobic conditions, inactivation of the ppsR gene resulted in overproduction of carotenoid and bacteriochlorophyll pigments, while the production of LH2 was drastically reduced. The β-galactosidase activity showed that, in contrast to what has been found previously for Rhodobacter species, PpsR acts in R. gelatinosus as an aerobic repressor of the crtI gene while it acts as an activator for the expression of pucBA. Inspection of the putative PpsR-binding consensus sequences revealed significant differences that may explain the different levels of expression of the two genes studied

Oxydases terminales chez la bactérie pourpre Rubrivivax gelatinosus (rôle et mise en place dans la membrane)

La bactérie pourpre Rubrivivax gelatinosus se développe en utilisant la photosynthèse et la respiration. Dans le cadre des études menées sur la régulation des gènes photosynthétiques par l oxygène, nous nous sommes intéressés à l étude des oxydases terminales, enzymes catalysant la réduction de l oxygène en eau dans la respiration. Dans ce travail, nous avons étudié le rôle physiologique de ces complexes et la mise en place de leurs cofacteurs. Nous avons identifié deux oxydases terminales, cbb3 et bd, fonctionnelles dans la souche sauvage. Un suppresseur exprimant l oxydase caa3 a été également sélectionné. Notre travail a permis de montrer que ces oxydases terminales jouent un rôle important dans l initiation de la photosynthèse. Ainsi, l activité de ces complexes a pour conséquence la réduction de l oxygène nécessaire à l expression des gènes photosynthétiques. Nous avons également analysé les caractéristiques spectroscopiques de l oxydase cbb3 par RPE et par spectroscopie UV/visible. L hème c de la sous-unité CcoO de cette oxydase présente deux position du 6ème ligand axial, Met143 et His130. Ce changement de ligand s accompagne d un changement de potentiel redox, probablement important pour l activité de l enzyme. L identification des oxydases de type hème-cuivre, cbb3 dans la souche sauvage et caa3 dans un suppresseur, a permis d initier une étude sur leur biogenèse et particulièrement la mise en place du cuivre. Cette étude a permis d identifier un transporteur putatif CtpA et des chaperonnes qui permettraient la mise en place de ce métal dans ces oxydases mais aussi dans la N2O réductase, enzyme de la chaîne de dénitrification.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF