폐암세포주의 유전적 특성에 따른 페메트렉세드(pemetrexed)의 내성 기전

학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :의과대학 의학과,2020. 2. 이종석.서론: 페메트렉세드는 비소세포폐암의 치료에 매우 중요한 항암제이다. 이전에 일부 연구자들은 적혈구 미세 소관 관련 단백질 유사 4 (EML4)-역형성 림프종 키나제 (ALK) 재배열이 있는 비소세포폐암에서 페메트렉세드의 치료 효과가 더 우월하다는 결과를 보고한 바 있다. 이 연구의 목적은 비소세포폐암에서 페메트렉세드에 대한 내성을 획득하는 기전을 규명하고, 이를 극복하는 방법을 개발함으로써 향후 임상적인 유용성을 평가하고자 하는 것이다. 이 연구에서는 여러 가지 비소세포폐암 세포주를 이용하여, 각 세포주가 가지고 있는 다양한 유전적 특성에 따른 페메트렉세드의 민감도와 내성 획득 양상의 차이를 분석하였다. 연구방법: EML4-ALK variant 1 재배열이 있는 폐선암 세포인 NCI-H3122 세포주와 EML4-ALK variant 3 재배열이 있는 NCI-H2228 세포주, 그리고 EML4-ALK 재배열이 없는 비소세포폐암 세포주인 A549와 NCI-H460이 실험에 이용되었다. 각 세포주에 페메트렉세드를 처리한 후 세포의 생존 양상을 비교하고 세포 주기를 분석함으로써 페메트렉세드에 대한 각 세포주의 민감도와 반응 기전을 평가하였다. 또한 A549, NCI-H460 및 NCI-H3122 세포주를 페메트렉세드의 농도를 점차 증가시켜가면서 장기간 노출시켜 배양함으로써 각각의 페메트렉세드-내성 세포주를 확립하였다. 만들어진 내성 세포주와 부모 세포주에 페메트렉세드를 처리한 후 세포의 생장 곡선을 비교하여 내성 발생을 확인하였으며, 부모 세포주와 내성 세포주의 증식 능력을 비교하기 위해 콜로니 생성 능력을 평가하였다. 또한 페메트렉세드 내성 획득 후 세포 내의 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR), 사람 표피 성장인자 (human epidermal growth factor receptor, HER) 관련 신호전달체계를 비롯한 각종 요소의 발현 변화를 확인하기 위해, 내성 세포주와 부모 세포주에 대해 웨스턴 블롯, 수용체 티로신 키나제 단백질 어레이 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 시행하였다. 페메트렉세드 내성 획득에 관여하는 EGFR 및 사람 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 관련 신호전달체계의 활성화를 억제함으로써 페메트렉세드 내성을 극복할 수 있는지 확인하기 위해, 내성세포주에 게피티닙, 라파티닙, 아파티닙, 크리조티닙과 같은 EGFR-HER 및 ALK 연관 신호전달체계 억제제들과 다양한 세포독성 항암제를 처리한 후 세포 생장 곡선을 비교하였다. 또한 내성극복기전을 확인하기 위해 억제제 처리 후의 AKT, MEK, 저산소증-유도성 인자 1 알파 등 하위 신호전달요소들의 농도를 웨스턴 블롯을 이용하여 비교 분석하였다. 결과: EML4-ALK variant 1 재배열이 있는 NCI-H3122는 다른 세포들에 비해 페메트렉세드에 좀더 민감한 것으로 나타났다. 세포주기 분석에서 A549, NCI-H460, NCI-H2228 세포주는 페메트렉세드 처리 후 S 분획이 증가한 반면, NCI-H3122에서는 sub-G1 분획이 증가하였다. 추가 실험을 통해 NCI-H3122에서 페메트렉세드에 의한 세포 사멸이 다른 세포주에 비해 낮은 농도에서 좀더 빨리 일어나는 것을 확인하였다. 페메트렉세드의 농도를 점차적으로 높여가면서 A549, NCI-H460, 그리고 NCI-H3122에 15개월간 노출시킨 결과, 페메트렉세드 내성 세포주를 확립하였다. 페메트렉세드 내성 A549, NCI-H460, NCI-H3122 세포주는 모두 각각의 부모 세포주에 비해 콜로니 생성 능력이 떨어져 있었다. 수용체 티로신 키나제 관련 단백질의 발현 수준을 각 세포주에서 비교한 결과 페메트렉세드 내성 NCI-H3122 세포주는 부모 세포주에 비해 EGFR 및 HER2의 발현이 증가되어 있었다. 이 변화는 EGFR 리간드의 농도에 비의존적이었기 때문에, 세포 내의 유전자적 변화에 기인한 것으로 생각된다. 페메트렉세드 내성 A549, NCI-H460 세포주에서는 이러한 변화가 관찰되지 않았다. EGFR 관련 신호 전달 경로를 억제하는 광범위 HER 억제제인 아파티닙은 NCI-H3122 부모 세포에서는 별다른 효과가 없었으나, 페메트렉세드 내성 NCI-H3122 세포주에서는 세포 사멸을 촉진하는 효과가 뚜렷하게 나타났다. 아파티닙은 또한 페메트렉세드 내성 NCI-H3122 세포에서 EGFR 신호 전달 경로 내의 요소들 및 저산소증-유도성 인자 1 알파의 발현을 억제하였다. 이는 페메트렉세드 내성을 획득하는 과정에서 활성화된 EGFR-HER 신호전달체계를 아파티닙으로 억제하면 추가적인 치료 효과를 기대할 수 있음을 시사한다. 결론: 페메트렉세드는 EML4-ALK 재배열이 있는 NCI-H3122에서 조기에 세포사멸반응을 유도한다. NCI-H3122에서 페메트렉세드 내성을 획득하였을 때 EGFR-HER 관련 요소들의 발현이 증가한다는 것은, EML4-ALK 재배열이 있는 비소세포폐암에서 페메트렉세드에 의해 억제된 ALK-연관 신호전달체계를 대신하여 EGFR-HER에 의한 세포 생존 기전이 활성화되는 기전이 페메트렉세드 내성 획득에 기여할 가능성을 시사한다. 광범위 HER 억제제인 아파티닙을 페메트렉세드 내성 NCI-H3122에 사용하면, 대체적으로 활성화된 신호전달체계를 억제하여 세포 생존을 저해함으로써, 페메트렉세드 내성을 극복할 수 있다.Introduction : Pemetrexed is an important therapeutic agent in the treatment of non-small cell lung cancer. Previous studies have shown that pemetrexed is more effective in cases of echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4) - anaplastic lymphoma kinase (ALK)-rearranged non-small cell lung cancer, though the mechanism remains unknown. The aim of this study was to elucidate the acquired resistance mechanisms of pemetrexed and to establish appropriate treatment strategies to overcome these resistance mechanisms. We compared the sensitivity and resistance patterns of pemetrexed in various lung cancer cell lines according to the genetic characteristics of the lung cancer. Materials and Methods : Non-small cell lung cancer cell lines A549, NCI-H460, NCI-H2228 harboring variant 3 type EML4-ALK rearrangement, and NCI-H3122 harboring variant 1 type EML4-ALK rearrangement were used in this experiment. Cell proliferation assay and cell cycle analysis were performed to compare the viability and the patterns of cell cycling of these cell lines after pemetrexed treatment. We established pemetrexed-resistant sublines in A549, NCI-H460, and NCI-H3122 cell lines through exposure to increasing concentrations of pemetrexed. Colony forming assay was used to compare the proliferation capacity of parental and pemetrexed-resistant cell lines. Western blot was performed to analyze the difference in protein expression between parental and pemetrexed-resistant cell lines. Receptor tyrosine kinase protein array and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) were performed to confirm the changes of receptor tyrosine kinase pathway-related protein expression including epidermal growth factor receptor (EGFR) and human epidermal growth factor receptor (HER) in the cells after acquisition of pemetrexed-resistance. Based on the mechanism of pemetrexed-resistance acquisition associated with EGFR and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), the cells were treated with various small molecular inhibitors of this signaling pathway such as gefitinib, lapatinib, afatinib, and crizotinib and several cytotoxic agents and their survival curves were compared to find a way to overcome this resistance. Results : EML4-ALK variant type 1-rearranged NCI-H3122 was found to be more sensitive to pemetrexed than the other cells. Cell cycle analysis after pemetrexed treatment showed that the fraction of the S phase was increased in A549, NCI-H460 and NCI-H2228, whereas the portion of apoptotic sub-G1 increased in NCI-H3122. Subsequent experiments confirmed that pemetrexed induced apoptotic cell death early in NCI-H3122 compared to other cells. After exposure to each cell line for about 15 months with increasing concentrations of pemetrexed, pemetrexed-resistant cell lines of A549, NCI-H460, and NCI-H3122 were established. Pemetrexed-resistant cell lines were inferior in colony forming capacity as compared to the parental cell lines. When the expression levels of the receptor tyrosine kinase family -related protein in the parent and resistance cells were compared in each cell line, the pemetrexed-resistant NCI-H3122 cell line showed an increased expression of EGFR and HER2 compared to the parental cell line. Since this change was not dependent on the levels of EGFR ligands, it appears to be due to genetic changes in the cell. The pan-HER inhibitor, afatinib, inhibited this alternative signaling pathway, resulting in a superior cytotoxic effect in pemetrexed-resistant NCI-H3122 cell lines than in parental cells. Afatinib also suppressed expression levels of several proteins of the receptor tyrosine kinase signaling pathway and hypoxia-inducible factor 1 alpha in pemetrexed-resistant NCI-H3122 cells, suggesting the possibility as a means to overcome resistance to pemetrexed. Conclusion : The NCI-H3122 cell line harboring EML4-ALK variant type 1 rearrangement was more susceptible to pemetrexed-induced cell death than other cell lines. When NCI-H3122 cell lines acquire resistance to pemetrexed, the expression of EGFR and HER is increased compared to the parent cell line. These results suggest that the alternative activation of EGFR-HER signal pathways may contribute to the acquisition of resistance to pemetrexed by non-small-cell lung cancer cells that are EML4-ALK rearrangement. Inhibition of this alternative survival signaling pathway with afatinib overcame this resistance.Introduction 1 Materials and Methods 3 1. Materials 3 2. Cell culture 4 3. Cell proliferation assay 6 4. Cell Cycle Analysis 6 5. Western Blot Analysis 6 6. Colony forming assay 7 7. Receptor tyrosine kinase protein array 7 8. Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) 8 9. RNA interference 9 10. Statistical Analysis 9 Results 11 1. Effect of PEM on cell viability, cell cycle, and apoptosis-associated protein expression in lung cancer cell lines 11 2. Development of PEM-resistant lung cancer cell lines 15 3. Alternative activation of the RTK family as a major mechanism mediating PEM-acquired resistance 17 4. Effect of acquired PEM resistance on the RTK ligands in NCI-H3122 cells 21 5. Overcoming PEM resistance by using tyrosine kinase inhibitor (TKI) 23 6. Effect of the TKIs on RTK downstream cascade and colony formation in NCI-H3122 R cells 32 Discussion 35 References 40 국문초록 46Docto

진행성 비편평상피세포성 비소세포폐암에서 페메트렉세드(pemetrexed)에 의한 장기간의 반응에 대한 예측인자

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 의학과 분자종양의학, 2011.8. 이종석.Maste

Evaluation of dental information on the internet

학위논문(석사) --서울대학교 대학원 :치의학과, 2009.2.Maste

치수세포에 대한 과산화수소 세포독성 및 치과용 레진 단량체의 분화 저해 기전 연구

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 치의과학과(치과생체재료과학전공), 2014. 2. 양형철.1. 목 적 치과용 미백제의 주요 활성물질인 과산화수소는 구강세포에 산화 스트레스를 유발하여 세포독성을 유발할 수 있으며, 치수세포는 치수강을 통하여 과산화수소에 노출될 위험이 있다. 또한 치수세포는 레진계 상아질 접착제 및 수복 재료에서 유출되는 미중합 레진 단량체에 노출될 위험성이 항상 존재한다. 치수세포는 3차 상아질의 형성에 매우 중요한 역할을 담당하므로, 과산화수소 및 레진 단량체 등의 외부 독성 물질에 의해 치수세포의 기능이 저해될 수 있으며, 최종적으로 치아의 수명이 감소할 수 있다. 본 연구에서는 과산화수소의 농도와 노출시간을 달리하여 치수세포의 생존율을 조사하고, 임상에서 사용되는 치아 미백제의 독성 연구에 기초 자료를 제시하고자 하였다. 또한 레진 단량체 중에서 유출이 가장 많이 되는 것으로 알려져 있는 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)와 triethylene glycol dimethacrylate (TEGDMA)의 치수세포 분화 저해 정도를 조사하고, 분화 저해 기전을 밝히고자 하였다. 2. 방 법 다양한 농도의 과산화수소로 노출시간을 달리하여 치수세포을 처리하였으며, 세포독성은 WST 법 (modified MTT 법), 치수세포 내 활성산소종은 2`,7`-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)를 이용하여 측정하였다. 비가역적 세포사멸을 초래하는 과산화수소의 농도 및 노출시간을 결정하였으며, 활성산소 측정을 통하여 세포사멸에 대한 hydroxyl radical의 기여 정도를 조사하였다. 치수세포 분화에 대한 HEMA 및 TEGDMA의 영향은 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 조사하였다. 분화에 대한 영향 평가를 위해 alkaline phosphatase (ALP) 활성, dentin sialophosphoprotein (DSPP), osteocalcin (OCN), osteopontin (ONV)의 발현을 관찰하였다. 레진 단량체의 분화 저해 기전을 조사하기 위하여, ERK1/2, JNK, p38 발현 변화를 분석하였다. 3. 결 과 과산화수소가 치수세포의 생존율에 미치는 영향을 평가한 결과 과산화수소의 노출농도와 노출시간이 증가 할수록 세포의 생존율이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 세포 세척시간이 길수록 세포 생존율이 효과적으로 회복되는 것이 관찰되었다. 과산화수소에 30분 동안 5 mM이하, 60분 동안 2.5 mM이하 노출된 치수세포는 세척시간에 따라 세포 생존율이 회복되는 가역적인 세포독성을 나타내었다. 그러나 보다 높은 농도에서 오랜 시간 과산화수소에 노출될 경우 세포 생존율이 회복되지 않는 비가역적인 독성이 나타났다. 치수세포 내의 hydroxyl radical은 과산화수소의 노출농도와 노출시간에 비례하여 증가하였다. Fenton reaction inhibitor로 알려진 deferoxamine (DFO)과 과산화수소를 함께 처리하였을 때 효과적으로 hydroxyl radical이 제거 되었지만, 세포의 생존율 회복에는 큰 영향을 미치지 않았다. TEGDMA와 HEMA가 치수세포의 생존율과 ALP 활성도에 미치는 영향을 평가한 결과 단량체의 농도가 증가 할수록 생존율과 ALP 활성도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. TEGDMA는 1 mM, HEMA는 4 mM 이상의 농도에서 세포독성이 나타났다. ALP 활성도는 TEGDMA 0.5 mM, HEMA 2 mM이상에서 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 단량체들이 제거된 후에도 5일 동안 감소된 치수세포의 ALP 활성도가 완전히 회복되지 못하는 것이 관찰되었다. 세포독성은 나타나지 않지만 ALP 활성도가 저해되는 단량체의 농도 (TEGDMA 0.5 mM, HEMA 2 mM)를 설정하여 치수세포의 유전자에 미치는 영향을 조사하였다. 단량체가 처리된 치수세포는 분화능과 관련된 유전자인 DSPP, OCN, OPN의 발현이 모두 저하된 것을 확인할 수 있었다. Western blot을 통해 단량체가 치수세포의 분화 저해 기전을 조사하였다. 단량체가 처리된 치수세포의 ERK1/2, JNK, p38 단백질 발현 변화를 관찰한 결과 p38이 TEGDMA와 과산화수소에 영향을 받는 것이 관찰되었다. 3시간 동안 TEGDMA 0.5 mM, 과산화수소 0.2 mM에 노출된 치수세포의 p38 단백질 발현이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 TEGDMA가 p38 신호전달체계에 변화를 유발하여 최종적으로 치수세포의 분화능 저하를 야기한 것으로 판단된다.1. 서론 1.1 치수세포에 대한 과산화수소의 영향 1.2 치수세포에 대한 치과용 레진 단량체의 영향 2. 재료 및 방법 3. 결과 3.1 과산화수소의 세포독성 3.2 과산화수소에 의해 저하된 세포 생존율의 변화 3.3 과산화수소가 치수세포의 하이드록시기 양에 미치는 영향 3.4 DFO와 과산화수소에 노출된 치수세포의 생존율 측정 3.5 레진 단량체의 세포독성 3.6 레진 단량체가 치수세포의 ALP 활성도에 미치는 영향 3.7 레진 단량체에 의해 저해된 치수세포 ALP 활성도의 변화 3.8 레진단량체가 치수세포의 mRNA 발현에 미치는 영향 3.9 레진 단량체가 MAP-kinases 발현에 미치는 영향 4. 결론 및 고찰 5. 참고문헌Maste

젊은 여성의 유방에 발생한 원발성 활막 육종 1예

활막 육종은 주로 관절 주위 조직에 호발하는 악성 종양이다. 종종 관절 이외의 다른 부위에 발생하는 경우도 보고되어있는데, 원발성 유방 활막 육종은 세계적으로도 보고된 예가 드물다. 본 증례는 원발성 유방 활막 육종으로 진단된 15세 여자 환자의 1예이다. 진단 후 유방 종괴에 대한 광범위 절제술을 시행하였으나 9개월 후 국소 재발하였고, 이에 재발 부위에 대한 광범위 절제술을 다시 시행하였다. 그러나, 27개월 후 폐의 우상엽에 고립성 폐 전이가 발견되었다. 이에 폐 병변에 대한 절제술 및 고식적 화학요법으로 doxorubicin 및 ifosfamide의 병합 화학요법을 시행하였다. 현재 항암화학요법 종료 후 28개월째 재발의 증거 없이 경과관찰 중이다. 이에 저자들은 본 증례를 문헌고찰과 함께 보고하는 바이다