Purification of HBV Particles from Patients' Serum

人類B型肝炎病毒是帶有外套膜的DNA病毒，內有一個二十面體的核心顆粒。在受到病毒感染的肝細胞中，核心顆粒的組裝是在細胞質中發生，組裝的過程中伴隨著包裹前基因體RNA與病毒DNA聚合酶的結合複合體和一些細胞因子像是熱休克蛋白與會磷酸化核心蛋白的磷酸激酶。磷酸激酶的活性在其他種類的肝炎病毒中也有被發現，並有一些研究鑑定出具有此活性之蛋白質。而熱休克蛋白像是Hsp90、Hsp70、p23都有報導說其對於病毒進行protein priming與病毒顆粒組裝是必需的。這些細胞蛋白質似乎在HBV生活史中，都扮演很重要的角色。因此我們很有興趣去找尋在病毒顆粒中，被特定包裹於其中的細胞蛋白質。 為了能取得大量的病毒顆粒，於是我們選擇使用HBV感染者的血清來當做純化病毒的來源。利用不同濃度硫酸銨沉澱與sucrose cushion來去除血清中大量的血清蛋白像是白蛋白(albumin)。再接著使用蔗糖濃度梯度與氯化銫密度梯度，成功的分離出高純度的病毒顆粒，並同時將表面抗原顆粒與鄧氏顆粒分離出來。我們再利用電子顯微鏡和南方墨點法確認病毒顆粒的結構與鄧氏顆粒內的DNA基因體。最後，我們建立了一套能夠從血清中獲得高純度的病毒顆粒純化方法。The hepatitis B virus (HBV) is an enveloped DNA virus with an icosahedral nucleocapsid. In an HBV infected cell, assembly of nucleocapsid occurs in the cytosol and is accompanied by packaging of the viral pregenomic RNA bound to the viral polymerase protein together with cellular protein such as chaperons and protein kinases phosphorylating core protein. This kinase activity is also conserved in other members of hepadnaviridae and plays an important role in viral life cycle. Besides, chaperons like hsp90,hsp70 ,p23 are required for protein priming and encapsidation .Therefore , we are interested in finding out specific cellular proteins incorporated into HBV virions. In order to obtain enough quantity of hepatitis B virus, we chose serum from HBV-infected patients as materials for virus purification. Ammonium sulfate precipitation and sucrose cushion were used to remove high abundant serum proteins, like albumins. After sucrose gradient and cesium chloride gradient, Dane particles and empty particles were obtained with high purity. Then we utilized electron microscopy and Southern-blotting to confirm the structure of particles and virus genome inside Dane particles. Finally, we set up a system for virus purification from serum with high purity.中文摘要……………………………………………………………… .Ⅱ 英文摘要……………………………………………………………… .Ⅲ 目錄…………………………………………………………………… .Ⅳ 表次……………………………………………………………………. Ⅴ 圖次……………………………………………………………………. Ⅵ 壹、序論 B型肝炎病毒簡介…………………………………… .1 B型肝炎病毒的基因與蛋白質……………………… .2 B型肝炎病毒結構…………………………………… .3 B型肝炎病毒的生活史………………………………..4 細胞蛋白與病毒蛋白之交互作用…………………….5 研究目的……………………………………………… 9 貳、材料與方法 大腸桿菌之轉形(Transformation)………………… 10 HBV copy number 標準品之製備………………….. 10 HBV病毒顆粒之純化………………………………… 11 HBV病毒DNA之萃取……………………………….....12 定量即時聚合酶連鎖反應…………………………… 13 TCA(Trichloroacetic acid)沉澱法……………… 14 南方墨點法(Southern blotting)………………… 14 西方墨點法(Western blotting)…………………… 16 銀染法(Silver stain)……………………………… 17 穿透式電子顯微鏡及負染法………………………….17 參、結果 (一) 所需病毒之來源……………………………………………18 (二)硫酸銨沉澱病毒顆粒……………………………………….18 (三)蔗糖濃度梯度分離不同大小的病毒顆粒………………….19 (四)氯化銫密度梯度分離鄧氏顆粒與次病毒顆粒…………….20 (五)證明鄧氏顆粒存在………………………………………….21 肆、討論……………………………………………………………….23 附表…………………………………………………………………….27 附圖…………………………………………………………………… 30 伍、參考文獻………………………………………………………….44 表次 表一、不同硫酸銨濃度中，表面抗原與DNA的含量………28 表二、病毒純化之回收率……………………………………29 圖次 圖一、B型肝炎病毒顆粒種類及結構…………………………………31 圖二、B型肝炎病毒生活史……………………………………………32 圖三、肝炎病毒核心顆粒組裝之假設模型……………………………33 圖四、不同的硫酸銨濃度沉澱血清內的蛋白…………………………34 圖五、用不連續蔗糖濃度梯度純化HBV病毒顆粒…………………..35 圖六、用氯化銫密度梯度分離出次病毒顆粒…………………………36 圖七、氯化銫fraction中的蛋白質分析(Ⅰ)……………………… 37 圖八、用氯化銫密度梯度分離出鄧氏顆粒……………………………38 圖九、氯化銫fraction中的蛋白質分析 (Ⅱ)…………………… .39 圖十、氯化銫fraction中的蛋白質分析 (Ⅲ)………………………40 圖十一、濃縮後的病毒液與病毒蛋白分析……………………………41 圖十二、電子顯微鏡觀察結果…………………………………………42 圖十三、南方墨點法偵測病毒基因體…………………………………4

Functional dissection of dopaminergic neurons underlying male-male courtship behavior in Drosophila

[[abstract]]求偶是自然界動物的一種本能，動物利用許多種感覺訊號去辨識同種間且合適的伴侶進行求偶行為，進而繁演後代。通常求偶行發生於異性之間；然而，研究證實自然界中之動物同性之間的求偶與性行為在許多物種間皆存在，所涉及的生物因子與分子機轉目前仍尚未被釐清。果蠅在遺傳學上提供了適切的遺傳分析工具與大規模研究的優勢，同時求偶行為的分析與量化已被清楚的確定。正常情況下，果蠅之間很少會出現同性求偶行為，利用基因操作的手法可以大幅提高這些行為的發生。多巴胺(Dopamine；DA)對於動物而言是一個非常重要的神經傳導物質；在許多研究陸續發現，多巴胺含量不正常表現時，會大幅增加同性求偶行為的發生。在本研究中，藉由Murashka-1 Gal4驅動多巴胺生合成路徑之酪胺酸羥化?(tyrosine hydroxylase；TH)大量表現，將導致Murashka-1神經元之多巴胺分泌量升高，可明顯觀察到雄果蠅同性間之求偶行為，但不會影響其對雌性果蠅的求偶行為。另外，本文也藉由UAS-THi基因轉殖果蠅，透過核醣核酸干擾酪胺酸羥化?的表現，在零照度下可以觀察到當Murashka-1神經元之多巴胺分泌量降低之雄性果蠅吸引Murashka-1神經元之多巴胺分泌量升高之雄性果蠅進行求偶行為。本論文顯示Murashka-1神經元，在調控雄果蠅同性間求偶行為的發生扮演了重要的角色。[[abstract]]Courtship behavior is fundamental to the propagation of animal species. Animals use multiple sensory cues to recognize conspecifics and to choose a potentially suitable mate for reproduction. A courtship behavior occurs in heterosexual usually. The recent study found that sexual behavior between males is observed in many species, but the biological factors involved are poorly known. Although wild-type male flies rarely show male–male courtship, the frequency and intensity of this behavior can be strongly increased by genetic manipulation. Dopamine (DA) is a very important neuromodulator in animals. Its role in mammal heterosexual behavior has been extensively studied. Studies demonstrate that DA elevation can enhance male-male courtship behavior in Drosophila. We used genetic approach to increasing dopamine level by UAS-TH under a driver of Murashka-1 and showed enhanced propensity to court other males but did not change their courtship toward virgin females and locomotor activity. Consistently, the knocking downs of dopamine by UAS-THi under a same driver of Murashka-1 and investigated increased male attractiveness or decrease aversiveness towards other males in dark. Our results show that the Murashka-1 expressing neurons played an important role in the regulation of the promotion of male courtship among fruit flies homosexual behavior among the production.[[note]]碩

非導體基材化學鍍之研究

[[abstract]]本實驗使用ABS非導體基材進行化學鍍鎳與鍍銅，主要探討各種配位劑及穩定劑對其之影響，配位劑使用檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、焦磷酸鈉及醋酸鈉。穩定劑則使用Thiourea。配位劑中檸檬酸鈉最為穩定，但速率較慢；酒石酸鉀鈉速率快而不穩定；焦磷酸鈉鍍層細緻，但鍍液易分解；醋酸鈉則針孔率高，較不適用於化學鍍。穩定劑中，硫脲的效果極好，但份量控制困難。以此為基礎，可以進而探討其他條件，測試其其他性能，得到可供應用的鍍液配方

迷宮機器人之設計與實作

[[abstract]]在網路上常看到現代科技應用於機器人的應用，藉以解決生活或產業的作業需求，讓我們對於機器人的設計與運用充滿新鮮感與好奇。在系上的程式設計實務課程中，學習到Java程式語言設計及運用程式控制樂高機器人的範例，學習過程主要是以LeJOS為發展環境，透過Java程式語言進行軟硬體整合方式，進行作品的競技觀摩，達到學習的效果。由於課程的靈活應用，也激起我們嘗試以迷宮機器人做為實務專題的探討題目。 本次專題的探討內容主要是建構一臺樂高輪型機器人，先能夠達到前進、後退、左轉及右轉的基本功能，然後再加上循跡移動及偵測圍牆障礙的能力，最後再改進設計，使機器人能具備自動選擇路徑及在限制時間內獲得最多積分的能力，感應方式包括利用光線感應器偵測路徑及超音波感應器偵測是否遇到牆壁及路口通路狀況。最後，分享作品實際迷宮場地驗證及發展過程中的問題及經驗