基于立即早期蛋白IE62建立水痘-带状疱疹病毒感染性滴度检测方法

目的:基于水痘-带状疱疹病毒(VZV)立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点检测技术(ELISpot)建立一种新型的VZV感染性滴度的快速检测方法。方法:应用生物信息学方法设计并合成VZV-IE62蛋白的多肽抗原,牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,筛选和制备抗VZV-IE62单克隆抗体,应用Western blot和免疫荧光法等开展抗体性能评价,继而应用酶联免疫斑点技术(ELISpot)结合生物素-亲和素放大法建立新型的VZV感染性滴度检测方法,并与经典空斑计数法进行比较。结果:获得抗VZV-IE62的单克隆抗体1B7,应用于ELISpot方法可特异识别VZV感染后的细胞,以之为基础建立了新型的VZV感染性滴度检测方法。相比经典空斑计数法,该方法可显著缩短检测时间(从5至7 d缩短至32 h)检测结果具有较好的一致性。结论:本研究建立了一种新型的基于VZV立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点技术的VZV感染性滴度检测方法(VZV-IE62 ELISpot),具有潜在的转化应用前景,可为VZV的防治研究提供支持。国家自然科学基金项目(81601762)资

水痘-带状疱疹病毒主要衣壳蛋白ORF40单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗水痘-带状疱疹病毒(VZV)主要衣壳蛋白ORF40的单克隆抗体,对该蛋白在VZV感染细胞内的表达、分布以及在VZV病毒颗粒中的包含情况进行初步探究。方法:设计并合成VZV ORF40多肽片段,偶联...国家自然科学基金项目(81601762)资

Preparation of Monoclonal Antibodies against Glycoprotein N of Varicella-zoster Virus and a Preliminary Study

水痘-带状疱疹病毒(VZV)是水痘和带状疱疹的共同致病原,其糖蛋白N(gN)在子代病毒的组装、成熟和出胞过程中发挥重要作用。但是目前关于VZV; gN的研究还很少,其蛋白性质和具体分子功能仍不清楚。本研究目的是制备抗VZV; gN的单克隆抗体,对该蛋白在VZV感染细胞和人皮肤组织内的表达和分布情况进行初步探究。本研究选择抗原性和亲水性较强的gN区段基因,构建rGST-; gN融合蛋白的原核表达质粒,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导融合蛋白表达,经亲和层析柱纯化rGST-gN融合蛋白后使用PSP酶切; 除GST标签,将获得的重组蛋白rgN免疫BALB/c小鼠,使用杂交瘤技术制备其单克隆抗体;共获得24株稳定分泌抗VZV; gN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取其中一株性能最优的12E10进行单克隆抗体生产纯化和抗体鉴定;单克隆抗体12E10为IgG2a亚型,其ELIS; A效价达到1∶10 000;通过Western blot、免疫荧光及免疫组织化学染色方法鉴定,该抗体能够特异性识别细胞和组织中表达的VZV; gN;本研究应用该抗体首次确定了gN在VZV感染细胞中的反式高尔基体定位,并且确定了gN在VZV感染人皮肤组织中的表达。以上工作为今后深入研究V; ZV gN功能奠定了基础。Varicella-zoster virus(VZV)is the causative agent for both; varicella(chicken pox)and herpes zoster(shingles).Glycoprotein; N(gN)plays an important role in VZV virion assembly,maturation and; egress.However,properties and the precise molecular functions of VZV gN; are still unclear.This research is to prepare monoclonal; antibodies(mAbs)specific for VZV gN,and study its expression and; localization in VZV-infected cells and human skin; tissues.Firstly,apotentially antigenic and hydrophilic region of VZV gN; was selected to construct its prokaryotic expression plasmid.Then,the; correct recombinant plasmid was transformed into E.coli,and IPTG was; used to induce the expression of the fusion protein rGST-gN.After; purification by affinity chromatography,rGST-gN was cut with PreScission; protease(PSP)to remove GST tag,and the resulting protein rgN was used to; immunize BALB/c mice.MAbs were prepared by hybridoma technique.A total; of 24 hybridoma cell lines secreting mAbs against VZV gN were; obtained,and one of them,12E10,was selected for mAb production and; characterization.The results showed that the Ig subclass of 12E10 was; IgG2 a,and it exhibited an ELISA titer of 1∶10,000.12E10 can be used to; detect expression of VZV gN in cell lines and tissues in Western; blot,immunofluorescence and immunohistochemistry.In addition,our study; for the first time determined the trans-Golgi network(TGN)localization; of gN in VZV-infected cells,and we confirmed the expression of gN in; VZV-infected human skin tissues.Overall,the above work laid the; foundation for further research on the function of VZV gN.国家自然科学基