EST analysis of the pituitary of the grouper and Cloning, identification and Characterization of GTH Genes in Groupers

石斑鱼是重要的海产经济鱼类，在其个体发育过程中存在先雌后雄的天然性反转现象。人工养殖的环境下石斑鱼很少发生自发的性反转，因此，由于野生雄鱼不易获得，大规模人工养殖难以推广。垂体是调节生长和生殖等生理过程的重要内分泌器官。在本研究中，我们构建了分别处于卵巢发育起始和性反转后期斜带石斑鱼垂体SMART cDNA的质粒文库，并通过测序分别筛选到232个和258个EST。将所得EST与GenBank数据库中的序列进行比对，处于卵巢发育起始和性反转后期的斜带石斑鱼垂体EST中，激素所占比例均为最高，分别为40.5％和34.9%。进一步比较分析了这两个性腺发育时期斜带石斑鱼垂体EST中各种激素相对表达丰度。与处于卵巢发育起始时期相比，处于性反转后期的斜带石斑鱼垂体中的生长/催乳激素家族（GH、PRL和SL）、促甲状腺激素β亚基（TSHβ）和阿黑皮素原（POMC）表达水平下降；促性腺激素α亚基（GTHα）表达水平急剧上升，促滤泡激素β亚基（FSHβ）、促黄体激素β亚基（LHβ）表达水平上升。 从垂体SMART cDNA质粒文库中筛选到的EcGTHα、EcFSHβ和EcLHβ基因的全长cDNA分别为647、574和594bp，分别编码94、99和115个氨基酸残基的成熟多肽。EcGTHα、EcFSHβ和EcLHβ与其它鱼类GTH亚基有很高的同源性。RT-PCR和Western blot分析表明EcGTHα、EcFSHβ和EcLHβ仅在垂体中表达；EcGTHα和EcFSHβ在三个不同性腺发育时期斜带石斑鱼垂体中的表达基本相似，但EcLHβ显示出明显的表达差异。EcLHβ在卵巢发育起始期维持高水平表达，卵巢成熟期表达下降，最后在性反转后期表达量急剧上升。将这三种亚基分别进行体外表达并制备了多克隆抗体。Western blot结果显示，处于休眠期卵巢发育时期赤点石斑鱼的垂体蛋白中，EaGTHα亚基几乎检测不到，EaFSHβ和EaLHβ亚基的表达量极低；而处于发育中卵巢时期赤点石斑鱼的垂体中GTH三个亚基的表达均上升到较高的水平。赤点石斑鱼垂体切片免疫荧光定位研究和血清ELISA同样得出了与Western blot分析相似的结论。以上多种技术研究了GTH三个亚基在石斑鱼不同性腺发育阶段的时空表达图谱，揭示出石斑鱼GTHα、FSHβ和LHβ不同于其它鱼类的表达特征。免疫荧光定位研究显示GTHα定位于石斑鱼垂体PPD区域、PI区域外围和RPD区域；FSHβ定位于PPD区域；LHβ定位于PPD区域和PI区域外围。双色荧光标记和激光共聚焦显微镜观察，清晰地将石斑鱼FSHβ和LHβ定位于垂体同一区域的不同细胞群中，为解决FSHβ和LHβ是否由同一细胞分泌这个长期争论的问题提供了确凿的细胞学证据。 鱼类存在两种GTH受体（GTHR），FSHR和LHR。本研究采用RACE-PCR方法，从赤点石斑鱼性腺中克隆了EaFSHR的全长cDNA和EaLHR的部分cDNA。EaFSHR cDNA的多聚腺苷酸尾前的序列长2393bp，编码701个氨基酸。EaFSHR多肽由信号肽（21aa）、胞外区（355aa）、跨膜区（264aa）和胞内区（61aa）构成。EaLHR仅获得跨膜区部分的cDNA。EaFSHR与其它鱼类有很高的同源性。RT-PCR结果表明EaFSHR为性腺特异表达，而EaLHR除了性腺中的表达外，在肝和脾中也有表达

中华鲟阿黑皮素原cDNA序列克隆及其序列分析

通过构建中华鲟（Acipenser sinensis）垂体的SMART cDNA质粒文库,首次从文库中筛选得到阿黑皮素原（Proopiomelanocortin,POMC）cDNA全长序列,分别为阿黑皮素原A型基因（Proopiomelanocortin I,AsPOMC-A,EV824935）和阿黑皮素原B型基因（Proopiomelanocortin II,AsPOMC-B,EV825368）。其中,AsPOMC-A和AsPOMC-B分别在文库中出现128次和19次。AsPOMC-A全长1122 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。AsPOMC-B全长1216 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。以其氨基酸序列为分子标记,比较了3种鲟鱼的共6种POMC的氨基酸同源性,并利用已报道的鱼类的POMC氨基酸序列构建了系统发育树,可识别2个大的单系类群,即类群I：非新鳍亚纲类群（仅包含辐鳍亚纲的长吻雀鳝）,类群II：新鳍亚纲类群。AsPOMC可能是一种进化上更原始的基因

中华鲟阿黑皮素原 cDNA 序列克隆及其序列分析

通过构建中华鲟(Acipenser sinensis)垂体的 SMART cDNA 质粒文库, 首次从文库中筛选得到阿黑皮素原(Proopiomelanocortin, POMC) cDNA 全长序列, 分别为阿黑皮素原 A 型基因 (Proopiomelanocortin I,AsPOMC-A, EV824935) 和阿黑皮素原 B 型基因(Proopiomelanocortin II, AsPOMC-B, EV825368)。 其中,AsPOMC-A 和 AsPOMC-B 分别在文库中出现 128 次和 19 次。AsPOMC-A 全长 1122 bp, 有 792 bp 的开放阅读框, 共编码 264 个氨基酸。 AsPOMC-B 全长 1216 bp, 有 792 bp 的开放阅读框, 共编码 264 个氨基酸。以其氨基酸序列为分子标记, 比较了 3 种鲟鱼的共 6 种 POMC 的氨基酸同源性, 并利用已报道的鱼类的 POMC氨基酸序列构建了系统发育树, 可识别 2 个大的单系类群, 即类群 I: 非新鳍亚纲类群(仅包含辐鳍亚纲的长吻雀鳝), 类群 II: 新鳍亚纲类群。AsPOMC 可能是一种进化上更原始的基因

中华鲟阿黑皮素原cDNA序列克隆及其序列分析

通过构建中华鲟（Acipenser sinensis）垂体的SMART cDNA质粒文库,首次从文库中筛选得到阿黑皮素原（Proopiomelanocortin,POMC）cDNA全长序列,分别为阿黑皮素原A型基因（Proopiomelanocortin I,AsPOMC-A,EV824935）和阿黑皮素原B型基因（Proopiomelanocortin II,AsPOMC-B,EV825368）。其中,AsPOMC-A和AsPOMC-B分别在文库中出现128次和19次。AsPOMC-A全长1122 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。AsPOMC-B全长1216 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。以其氨基酸序列为分子标记,比较了3种鲟鱼的共6种POMC的氨基酸同源性,并利用已报道的鱼类的POMC氨基酸序列构建了系统发育树,可识别2个大的单系类群,即类群I：非新鳍亚纲类群（仅包含辐鳍亚纲的长吻雀鳝）,类群II：新鳍亚纲类群。AsPOMC可能是一种进化上更原始的基因

中华鲟阿黑皮素原cDNA序列克隆及其序列分析

通过构建中华鲟（Acipenser sinensis）垂体的SMART cDNA质粒文库,首次从文库中筛选得到阿黑皮素原（Proopiomelanocortin,POMC）cDNA全长序列,分别为阿黑皮素原A型基因（Proopiomelanocortin I,AsPOMC-A,EV824935）和阿黑皮素原B型基因（Proopiomelanocortin II,AsPOMC-B,EV825368）。其中,AsPOMC-A和AsPOMC-B分别在文库中出现128次和19次。AsPOMC-A全长1122 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。AsPOMC-B全长1216 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。以其氨基酸序列为分子标记,比较了3种鲟鱼的共6种POMC的氨基酸同源性,并利用已报道的鱼类的POMC氨基酸序列构建了系统发育树,可识别2个大的单系类群,即类群I：非新鳍亚纲类群（仅包含辐鳍亚纲的长吻雀鳝）,类群II：新鳍亚纲类群。AsPOMC可能是一种进化上更原始的基因。</p

处于性腺不同发育阶段斜带石斑鱼垂体的EST表达差异分析

斜带石斑鱼是重要的海产经济鱼类,在其个体发育过程中存在先雌后雄的天然性反转现象。垂体是调节生长和生殖等生理过程的重要内分泌器官。构建了斜带石斑鱼分别处于卵巢发育起始和性反转后期的垂体SMARTcDNA的质粒文库,并通过测序分别筛选到232个和258个表达序列标签(expressed sequence tags,EST)。将所得EST与GenBank数据库中的序列进行比对,结果表明,处于卵巢发育起始和性反转后期斜带石斑鱼垂体EST中,激素所占比例均为最高,分别为40.5%和34.9%。进一步比较分析了这两

斜带石斑鱼生长催乳素基因全长cDNA的克隆、表达及其免疫荧光分析

我们从斜带石斑鱼垂体的SMART cDNA质粒文库中筛选到生长催乳素基因(so-matolactin，SL)的全长cDNA片段，其编码区为1644bp，编码231个氨基酸，其中N-端的24个氨基酸肽段为信号肽。运用RT-PCR技术考察了其在石斑鱼不同组织中的mRNA的转录水平，结果表明，该基因在垂体中大量转录，在其他组织中几乎检测不到转录本的存在。选取基因开放阅读框的核苷酸序列插入pGEX-KG载体进行原核表达，在大肠杆菌中表达的融合蛋白的分子量约为50kDa，并以表达的产物为抗原免疫家兔制备了多克隆抗体。采用冰冻切片和FITC标记的荧光染色方法将SL基因初步定位于脑垂体中部，沿着神经组织边缘分布。本研究为深入研究石斑鱼的生长激素／催乳激素家族的进化关系及SL基因的功能奠定了基础