지도 학습 기반 바이오패닝 클론 증폭 패턴 분석을 통한 항원 결합 반응성 예측

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의과학과, 2021.8. 정준호.Background: Monoclonal antibodies (mAbs) are produced by B cells and specifically binds to target antigens. Technical advances in molecular and cellular cloning made it possible to purify recombinant mAbs in a large scale, enhancing the multiple research area and potential for their clinical application. Since the importance of therapeutic mAbs is increasing, mAbs have become the predominant drug classes for various diseases over the past decades. During that time, immense technological advances have made the discovery and development of mAb therapeutics more efficient. Owing to advances in high-throughput methodology in genomic sequencing, phenotype screening, and computational data analysis, it is conceivable to generate the panel of antibodies with annotated characteristics without experiments. Thesis objective: This thesis aims to develop the next-generation antibody discovery methods utilizing high-throughput antibody repertoire sequencing and bioinformatics analysis. I developed novel methods for construction of in vitro display antibody library, and machine learning based antibody discovery. In chapter 3, I described a new method for generating immunoglobulin (Ig) gene repertoire, which minimizes the amplification bias originated from a large number of primers targeting diverse Ig germline genes. Universal primer-based amplification method was employed in generating Ig gene repertoire then validated by high-throughput antibody repertoire sequencing, in the aspect of clonal diversity and immune repertoire reproducibility. A result of this research work is published in ‘Journal of Immunological Methods (2021). doi: 10.1016/j.jim.2021. 113089’. In chapter 4, I described a novel machine learning based antibody discovery method. In conventional colony screening approach, it is impossible to identify antigen specific binders having low clonal abundance, or hindered by non-specific phage particles having antigen reactivity on p8 coat protein. To overcome the limitations, I applied the supervised learning algorithm on high-throughput sequencing data annotated with binding property and clonal frequency through bio-panning. NGS analysis was performed to generate large number of antibody sequences annotated with its’ clonal frequency at each selection round of the bio-panning. By using random forest (RF) algorithm, antigen reactive binders were predicted and validated with in vitro screening experiment. A result of this research work is published in ‘Experimental & Molecular Medicine (2017). doi:0.1038/emm.2017.22’ and ‘Biomolecule (2020). doi:10.3390/biom10030421’. Conclusion: By combining conventional antibody discovery techniques and high-throughput antibody repertoire sequencing, it was able to make advances in multiple attributes of the previous methodology. Multi-cycle amplification with Ig germline gene specific primers showed the high level of repertoire distortion, but could be improved by employing universal primer-based amplification method. RF model generates the large number of antigen reactive antibody sequences having various clonal enrichment pattern. This result offers the new insight in interpreting clonal enrichment process, frequency of antigen specific binder does not increase gradually but depends on the multiple selection rounds. Supervised learning-based method also provides the more diverse antigen specific clonotypes than conventional antibody discovery methods.연구의 배경: 단일 클론 항체 (monoclonal antibody, mAb) 는 B 세포에서 생산되어 표적 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 복합체 이다. 분자 및 세포 클로닝 기술의 발전으로 재조합 단일 클론 항체를 대용량으로 생산하는것이 가능해졌으며, 이를 바탕으로 다양한 연구 및 임상 분야에서의 활용이 확대되고 있다. 또한 치료용 항체를 효율적으로 발굴하고 개발하는 기술에 대한 비약적인 발전이 이루어졌다. 유전자 서열 분석, 표현형 스크리닝, 컴퓨팅 기반 분석법 분야에서 이루어진 고집적 방법론 (high-throughput methodology) 의 발전과 이의 응용을 통해, 비실험적 방법을 통해 항원 반응성 항체 패널을 생산하는것이 가능해졌다. 연구의 목표: 본 박사 학위 논문은 고집적 항체 레퍼토어 시퀀싱 (high-throughput antibody repertoire sequencing) 과 생물정보학 (bioinformatics) 기법을 활용하여 신규한 (novel) 차세대 항체 발굴법 (next-generation antibody discovery method) 을 개발하는것을 목표로 하고 있다. 본 연구를 통해 in vitro display 항체 라이브러리를 제작하기 위한 신규 프로토콜 및 기계 학습을 기반으로한 항체 발굴법을 개발 하였다. Chapter 3: 항체 레퍼토어를 증폭하는 과정에서, 다수의 생식세포 면역 글로불린 유전자 (germline immunoglobulin gene) 특이적 프라이머 사용에 의해 발생하는 증폭 편차 (amplification bias) 를 최소화 하는 방법론에 대해 기술하였다. 유니버셜 (universal) 프라이머를 사용한 다중 사이클 증폭 (multi-cycle amplification) 법이 사용되었으며, 고집적 항체 레퍼토어 시퀀싱을 통해, 클론 다양성 (clonal diversity) 및 면역 레퍼토어 재구성도 (immune repertoire reproducibility) 를 생물정보학적 기법으로 측정하여 신규 방법론에 대한 검증을 수행하였다. 본 연구의 연구결과는 다음의 학술지에 출판 되었다: Journal of Immunological Methods (2021). doi: 10.1016/j.jim.2021. 113089. Chapter 4: 기계 학습 기반의 항체 발굴법 개발에 대해 기술하였다. 전통적 콜로니 스크리닝 (colony screening) 방법에서는, 클론 빈도 (clonal abundance) 가 낮은 클론을 발굴 하거나 선택압 (selective pressure) 이 부여되는 과정에서, p8 표면 단백질의 비 특이적 항원 특이성을 제거할 수 없다. 이러한 제한점을 극복하기 위해서 항원 결합능 및 바이오패닝 에서의 클론 빈도가 측정 되어있는 고집적 항체 서열 데이터를 대상으로 지도 학습 알고리즘을 적용하였다. 랜덤 포레스트 (random forest, RF) 알고리즘을 적용하여 항원 특이적 항체 클론을 예측하였으며, 시험관 내 스크리닝을 통해 항원 특이성을 검증하였다. 본 연구의 연구 결과는 다음의 학술지에 출판되었다: 1) Experimental & Molecular Medicine (2017). doi:0.1038/emm.2017.22., 2) Biomolecule (2020). doi:10.3390/biom10030421. 결론: 전통적 항체 발굴 기술과 고집적 항체 레퍼토어 시퀀싱 기술을 융합함으로써, 기존 방법론의 다양한 한계점을 개선할 수 있었다. 면역 글로불린 생식세포 유전자 특이적 프라이머를 사용한 다중 사이클 증폭은 클론 빈도 및 다양성에 왜곡을 유도 하였으나, 유니버셜 프라이머를 사용한 증폭법을 통해 높은 효율로 레퍼토어 왜곡을 개선시킬 수 있음을 관찰할 수 있었다. RF 모델은 다양한 클론 증폭 패턴 (enrichment pattern) 을 가지는 항원 반응성 항체 서열을 생성하였다. 이를 통해 항원에 특이적으로 결합하는 클론이 단계적으로 증폭되는 것이 아니라 초기 및 후기의 다수의 선별 단계 (selection round) 에 의존함을 확인할 수 있었으며, 바이오패닝 에서의 클론 증폭에 대한 새로운 해석을 제시하였다. 또한 지도 학습을 기반으로 발굴 된 클론들에서, 전통적 콜로니 스크리닝 방법과 대비하여 더 높은 서열 다양성을 관찰할 수 있었다.1. Introduction 8 1.1. Antibody and immunoglobulin repertoire 8 1.2. Antibody therapeutics 16 1.3. Methodology: antibody discovery and engineering 21 2. Thesis objective 28 3. Establishment of minimally biased phage display library construction method for antibody discovery 29 3.1. Abstract 29 3.2. Introduction 30 3.3. Results 32 3.4. Discussion 44 3.5. Methods 47 4. In silico identification of target specific antibodies by high-throughput antibody repertoire sequencing and machine learning 58 4.1. Abstract 58 4.2. Introduction 60 4.3. Results 64 4.4. Discussion 111 4.5. Methods 116 5. Future perspectives 129 6. References 135 7. Abstract in Korean 150박