Astrocyte-specific Transcriptomic Response to PGC-1a Isoforms

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α (PGC-1α) transcriptional coactivators are key regulators of energy metabolism-related genes and are expressed in energy-demanding tissues. There are several PGC-1α variants that exert differential and specific biological functions. In the brain, PGC-1α1 has been implicated in reactive oxygen species detoxification but our understanding of the role of the other isoforms is far from complete. Previous results have shown that PGC-1α isoform expression levels can be modulated in the brain by stress conditions, suggesting a functional role for these proteins. Moreover, we have observed that increased expression of PGC-1α3 in astrocytes could be deleterious to neurons. In the adult brain, astrocyte-neuron crosstalk is crucial for neurite outgrowth, dendritic spine maintenance and synaptic function. The main objective of this study was to characterize the molecular pathways controlled by PGC-1α3 in in vitro neuronal and astrocytic experimental models. In parallel, we analysed the transcriptome of astrocytes transduced with a viral vector encoding PGC-1α3 by massively parallel sequencing (RNA-seq) in order to identify its downstream targets. The most striking hits, as well as the expression of other astrocyte-specific genes that could be involved in the neuronal response to PGC-1α3-overexpressing astrocytes, were determined by qPCR. We also used the Ingenuity Pathway Analysis suite to determine which pathways were being modulated as a result of differential expression of the identified hits. Our results show that PGC-1α3 can trigger Gq-coupled protein-mediate calcium dysregulation within astrocytes, inducing secretory pathways and neuroinflammation. In addition, our observations suggest a severe impairment of cell migration. Since proteins secreted by astrocytes play an important role in different neuronal physiological functions, we analyzed our RNA-seq data in order to predict the astrocytic secretome profile. Using a suite of bioinformatic tools we were able to identify candidate proteins putatively secreted through both canonical and non-canonical pathways. Combining these results with the analysis of the differentially expressed genes, led to the identification of Serpini1, Angptl4, galectin 9 and TGFβ as putative PGC-1α3 target genes. Interestingly, an extensive number of transcripts regulated by PGC-1α3 map to pseudogenes, which could potentially include miR sequences. Our results identify for the first-time an astrocyte-specific transcriptomic response to PGC-1α3 expression and highlight PGC-1α isoforms as novel therapeutic targets for the treatment of neurodegenerative diseases.O co-ativador 1 alfa do recetor gama ativado por proliferadores de peroxissoma (Peroxisome Proliferator-activated receptor-gamma Coactivator-1α - PGC-1α) é um regulador transcricional envolvido maioritariamente na expressão de genes relacionados com metabolismo energético, que, por sua vez, são expressos em tecidos com alta necessidade energética. Existem várias isoformas do PGC-1α que exercem funções biológicas específicas e distintas. No entanto, o nosso conhecimento sobre o seu papel no correto funcionamento do encéfalo está longe de estar completo. Os nossos resultados anteriores mostram que as diferentes formas do PGC-1α têm efeitos particulares em neurónios e astrócitos. Nomeadamente, observámos que o PGC-1α3 aumenta o conteúdo de colesterol nos neurónios e que aumento da expressão desta isoforma em astrócitos tem efeitos deletérios nos neurónios. No cérebro adulto, o crosstalk entre astrócitos e neurónios é essencial para o crescimento de neurites, manutenção das espinhas dendríticas e para a correta funcionalidade das sinapses. Como tal, o principal objetivo deste estudo foi o de caracterizar as vias sinalização controladas pelo PGC-1α3 em modelos experimentais astrocíticos e neuronais in vitro. Em paralelo, analisámos o transcriptoma de astrócitos infetados com um vetor viral que codifica para o PGC-1α3 através de sequenciação paralela massiva de RNA (RNA-Seq) com o objetivo de identificar os seus genes alvos diretos. Resultados obtidos em neurónios mostram que, após infeção de culturas primárias com o vetor adenoviral que codifica para o PGC-1α3, há uma diminuição significativa da expressão de proteína pós-sinápticas. No entanto, ao avaliarmos a atividade transcricional dos respetivos genes, observamos que esta não se correlaciona com o observado ao nível da expressão proteica. Assim, isto levou-nos a concluir que a ação do PGC-1α3 não será direta, mas sim sobre genes que codificam para proteínas envolvidas em modificações pós-transcricionais. Por exemplo, a ativação de calpaínas poderá justificar estes resultados, já que a sua função consiste na clivagem proteolítica induzida por aumento da concentração de cálcio intracelular. Através do processamento dos dados obtidos por RNA-Seq, observámos que o transcriptoma associado à expressão ectópica do PGC-1α3 em astrócitos apresenta uma diminuição transversal da expressão génica. Estes resultados vão de acordo com o previamente observado por outros estudos em que se mostra que o PGC-1α3 tem um perfil regulatório contrário ao do PGC-1α1 (forma canónica). De entre os mais de 300 genes diferencialmente expressos identificados por esta análise, determinámos os níveis de mRNA dos alguns dos que nos pareceram mais relevantes, na perspetiva da comunicação entre astrócitos e neurónios. Avaliámos ainda os níveis expressão de genes-chave envolvidos na comunicação entre astrócitos e neurónios, como transportadores de glutamato e genes envolvidos na sinalização do cálcio. Também utilizamos a lista dos genes identificados como diferencialmente expressos através da análise bioinformática para determinar quais as vias de sinalização que seriam mais afetadas pela alteração na expressão destes genes. Os nossos resultados mostram que o PGC-1α3 induz desregulação de cálcio mediado pela ação de recetores acoplados à proteína G e, consequentemente, a modelação das vias celular secretórias, assim como desempenha um papel na regulação da neuroinflamação. Para além disso, também observámos que a migração celular poderá estar fortemente reduzida. A análise efetuada aos resultados de RNA-Seq teve como propósito servir como ferramenta de descoberta, sendo que as tendências de expressão previstas pela mesma têm de ser validadas posteriormente por RT-qPCR. Surpreendentemente, observámos uma sobreexpressão de todos os genes que validámos. Tem sido sugerido que o PGC-1α3 poderá estar envolvido na regulação do splicing alternativo e, consequentemente, poderá induzir a produção de novos transcritos para diferentes genes. Isto poderá explicar as discrepâncias entre os nossos resultados obtidos pela análise bioinformática e os resultados de RT-qPCR, já que os novos transcritos não constam na nossa base de dados e, portanto, não conseguem ser identificados, indicando ausência de expressão. Os astrócitos são considerados como as principais células secretórias do sistema nervoso. Sendo que proteínas secretadas pelos menos desempenham um papel crucial em diferentes funções fisiológicas neuronais, analisámos novamente a nossa lista de genes diferencialmente expressos, mas desta vez para determinar o perfil secretório associado à expressão ectópica do PGC-1α3. Através de uma seleção de ferramentas bioinformáticas especificas que preveem através da sequência de um gene a presença ou ausência de péptido sinal, localização celular, domínios transmembranares e a probabilidade de ser secretada por vias não-convencionais, identificámos proteínas potencialmente secretadas através da via canónica e não canónica. Ao combinarmos estes resultados com as tendências de expressão previstas pela análise dos resultados de RNA-Seq, identificámos a Serpini1, Angptl4, galectina 9 e TGFβ como potenciais alvos da ação do PGC-1α3. Apesar do perfil de expressão génica previsto pela análise bioinformática seja maioritariamente repressivo, é de notar que os transcritos que se encontram aumentados são, em grande parte, identificados como pseudogenes. Os pseudogenes têm uma sequência nucleotídica muito semelhante a genes funcionais, só que, aparentemente, não desempenham nenhuma função celular. Devido à sua semelhança com outros genes, o aumento previsto da sua expressão poderia ser fruto de alinhamentos incorretos durante a análise bioinformática. Fomos então verificar se estes genes continham marcas epigenéticas relacionadas com a ativação da transcrição. Na verdade, nos loci onde os pseudogenes identificados se localizam, foram já identificámos marcadores de transcrição ativa, inclusivamente, marcadores específicos de long noncoding RNAs. Tanto os pseudogenes como os long noncoding RNAs têm sido descritos como reguladores da expressão génica, mais concretamente, estes pseudogenes podem estar envolvidos no buffering de miRs. Novamente, com base na nossa lista de genes diferencialmente expressos, identificámos miRs cujos níveis de expressão poderão estar a ser modulados pela sua expressão. Curiosamente, prevê-se que todos os miRs identificados estejam aumentados como consequência da sobreexpressão do PGC-1α3. Diferentes miRs têm sido descritos como essenciais à manutenção da homeostase cerebral assim como a sua desregulação tem sido associada ao desenvolvimento de neurodegeneração e, consequentemente, à patogénese de doenças neurodegenerativas. Assim, os nossos resultados identificam pela primeira vez o transcriptoma específico de astrócitos em resposta à sobreexpressão de PGC-1α3 e evidencia as isoformas do PGC-1α como novos alvos terapêuticos, abrindo assim novas estratégias terapêuticas em doenças neurodegenerativas.This work was supported by FEDER and national funds from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) (PTDC/MED-FSL/30104/2017 (to J.L.R) and UID/DTP/04138/2013), research grant SFRH/BPD/95855/2013 (to M.J.N.) and Swedish Research Council Consolidator Grant (to J.L.R.)

Astrocyte-specific Transcriptomic Response to PGC-1a Isoforms

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α (PGC-1α) transcriptional coactivators are key regulators of energy metabolism-related genes and are expressed in energy-demanding tissues. There are several PGC-1α variants that exert differential and specific biological functions. In the brain, PGC-1α1 has been implicated in reactive oxygen species detoxification but our understanding of the role of the other isoforms is far from complete. Previous results have shown that PGC-1α isoform expression levels can be modulated in the brain by stress conditions, suggesting a functional role for these proteins. Moreover, we have observed that increased expression of PGC-1α3 in astrocytes could be deleterious to neurons. In the adult brain, astrocyte-neuron crosstalk is crucial for neurite outgrowth, dendritic spine maintenance and synaptic function. The main objective of this study was to characterize the molecular pathways controlled by PGC-1α3 in in vitro neuronal and astrocytic experimental models. In parallel, we analysed the transcriptome of astrocytes transduced with a viral vector encoding PGC-1α3 by massively parallel sequencing (RNA-seq) in order to identify its downstream targets. The most striking hits, as well as the expression of other astrocyte-specific genes that could be involved in the neuronal response to PGC-1α3-overexpressing astrocytes, were determined by qPCR. We also used the Ingenuity Pathway Analysis suite to determine which pathways were being modulated as a result of differential expression of the identified hits. Our results show that PGC-1α3 can trigger Gq-coupled protein-mediate calcium dysregulation within astrocytes, inducing secretory pathways and neuroinflammation. In addition, our observations suggest a severe impairment of cell migration. Since proteins secreted by astrocytes play an important role in different neuronal physiological functions, we analyzed our RNA-seq data in order to predict the astrocytic secretome profile. Using a suite of bioinformatic tools we were able to identify candidate proteins putatively secreted through both canonical and non-canonical pathways. Combining these results with the analysis of the differentially expressed genes, led to the identification of Serpini1, Angptl4, galectin 9 and TGFβ as putative PGC-1α3 target genes. Interestingly, an extensive number of transcripts regulated by PGC-1α3 map to pseudogenes, which could potentially include miR sequences. Our results identify for the first-time an astrocyte-specific transcriptomic response to PGC-1α3 expression and highlight PGC-1α isoforms as novel therapeutic targets for the treatment of neurodegenerative diseases.O co-ativador 1 alfa do recetor gama ativado por proliferadores de peroxissoma (Peroxisome Proliferator-activated receptor-gamma Coactivator-1α - PGC-1α) é um regulador transcricional envolvido maioritariamente na expressão de genes relacionados com metabolismo energético, que, por sua vez, são expressos em tecidos com alta necessidade energética. Existem várias isoformas do PGC-1α que exercem funções biológicas específicas e distintas. No entanto, o nosso conhecimento sobre o seu papel no correto funcionamento do encéfalo está longe de estar completo. Os nossos resultados anteriores mostram que as diferentes formas do PGC-1α têm efeitos particulares em neurónios e astrócitos. Nomeadamente, observámos que o PGC-1α3 aumenta o conteúdo de colesterol nos neurónios e que aumento da expressão desta isoforma em astrócitos tem efeitos deletérios nos neurónios. No cérebro adulto, o crosstalk entre astrócitos e neurónios é essencial para o crescimento de neurites, manutenção das espinhas dendríticas e para a correta funcionalidade das sinapses. Como tal, o principal objetivo deste estudo foi o de caracterizar as vias sinalização controladas pelo PGC-1α3 em modelos experimentais astrocíticos e neuronais in vitro. Em paralelo, analisámos o transcriptoma de astrócitos infetados com um vetor viral que codifica para o PGC-1α3 através de sequenciação paralela massiva de RNA (RNA-Seq) com o objetivo de identificar os seus genes alvos diretos. Resultados obtidos em neurónios mostram que, após infeção de culturas primárias com o vetor adenoviral que codifica para o PGC-1α3, há uma diminuição significativa da expressão de proteína pós-sinápticas. No entanto, ao avaliarmos a atividade transcricional dos respetivos genes, observamos que esta não se correlaciona com o observado ao nível da expressão proteica. Assim, isto levou-nos a concluir que a ação do PGC-1α3 não será direta, mas sim sobre genes que codificam para proteínas envolvidas em modificações pós-transcricionais. Por exemplo, a ativação de calpaínas poderá justificar estes resultados, já que a sua função consiste na clivagem proteolítica induzida por aumento da concentração de cálcio intracelular. Através do processamento dos dados obtidos por RNA-Seq, observámos que o transcriptoma associado à expressão ectópica do PGC-1α3 em astrócitos apresenta uma diminuição transversal da expressão génica. Estes resultados vão de acordo com o previamente observado por outros estudos em que se mostra que o PGC-1α3 tem um perfil regulatório contrário ao do PGC-1α1 (forma canónica). De entre os mais de 300 genes diferencialmente expressos identificados por esta análise, determinámos os níveis de mRNA dos alguns dos que nos pareceram mais relevantes, na perspetiva da comunicação entre astrócitos e neurónios. Avaliámos ainda os níveis expressão de genes-chave envolvidos na comunicação entre astrócitos e neurónios, como transportadores de glutamato e genes envolvidos na sinalização do cálcio. Também utilizamos a lista dos genes identificados como diferencialmente expressos através da análise bioinformática para determinar quais as vias de sinalização que seriam mais afetadas pela alteração na expressão destes genes. Os nossos resultados mostram que o PGC-1α3 induz desregulação de cálcio mediado pela ação de recetores acoplados à proteína G e, consequentemente, a modelação das vias celular secretórias, assim como desempenha um papel na regulação da neuroinflamação. Para além disso, também observámos que a migração celular poderá estar fortemente reduzida. A análise efetuada aos resultados de RNA-Seq teve como propósito servir como ferramenta de descoberta, sendo que as tendências de expressão previstas pela mesma têm de ser validadas posteriormente por RT-qPCR. Surpreendentemente, observámos uma sobreexpressão de todos os genes que validámos. Tem sido sugerido que o PGC-1α3 poderá estar envolvido na regulação do splicing alternativo e, consequentemente, poderá induzir a produção de novos transcritos para diferentes genes. Isto poderá explicar as discrepâncias entre os nossos resultados obtidos pela análise bioinformática e os resultados de RT-qPCR, já que os novos transcritos não constam na nossa base de dados e, portanto, não conseguem ser identificados, indicando ausência de expressão. Os astrócitos são considerados como as principais células secretórias do sistema nervoso. Sendo que proteínas secretadas pelos menos desempenham um papel crucial em diferentes funções fisiológicas neuronais, analisámos novamente a nossa lista de genes diferencialmente expressos, mas desta vez para determinar o perfil secretório associado à expressão ectópica do PGC-1α3. Através de uma seleção de ferramentas bioinformáticas especificas que preveem através da sequência de um gene a presença ou ausência de péptido sinal, localização celular, domínios transmembranares e a probabilidade de ser secretada por vias não-convencionais, identificámos proteínas potencialmente secretadas através da via canónica e não canónica. Ao combinarmos estes resultados com as tendências de expressão previstas pela análise dos resultados de RNA-Seq, identificámos a Serpini1, Angptl4, galectina 9 e TGFβ como potenciais alvos da ação do PGC-1α3. Apesar do perfil de expressão génica previsto pela análise bioinformática seja maioritariamente repressivo, é de notar que os transcritos que se encontram aumentados são, em grande parte, identificados como pseudogenes. Os pseudogenes têm uma sequência nucleotídica muito semelhante a genes funcionais, só que, aparentemente, não desempenham nenhuma função celular. Devido à sua semelhança com outros genes, o aumento previsto da sua expressão poderia ser fruto de alinhamentos incorretos durante a análise bioinformática. Fomos então verificar se estes genes continham marcas epigenéticas relacionadas com a ativação da transcrição. Na verdade, nos loci onde os pseudogenes identificados se localizam, foram já identificámos marcadores de transcrição ativa, inclusivamente, marcadores específicos de long noncoding RNAs. Tanto os pseudogenes como os long noncoding RNAs têm sido descritos como reguladores da expressão génica, mais concretamente, estes pseudogenes podem estar envolvidos no buffering de miRs. Novamente, com base na nossa lista de genes diferencialmente expressos, identificámos miRs cujos níveis de expressão poderão estar a ser modulados pela sua expressão. Curiosamente, prevê-se que todos os miRs identificados estejam aumentados como consequência da sobreexpressão do PGC-1α3. Diferentes miRs têm sido descritos como essenciais à manutenção da homeostase cerebral assim como a sua desregulação tem sido associada ao desenvolvimento de neurodegeneração e, consequentemente, à patogénese de doenças neurodegenerativas. Assim, os nossos resultados identificam pela primeira vez o transcriptoma específico de astrócitos em resposta à sobreexpressão de PGC-1α3 e evidencia as isoformas do PGC-1α como novos alvos terapêuticos, abrindo assim novas estratégias terapêuticas em doenças neurodegenerativas.This work was supported by FEDER and national funds from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) (PTDC/MED-FSL/30104/2017 (to J.L.R) and UID/DTP/04138/2013), research grant SFRH/BPD/95855/2013 (to M.J.N.) and Swedish Research Council Consolidator Grant (to J.L.R.)

O Protagonismo Infantojuvenil nos Processos Educomunicativos

Neste volume “O protagonismo infantojuvenil nos processos educomunicativos”, reunimos 53 artigos que transitam sobre a temática do protagonismo infantojuvenil em diversas experiências e processos educomunicativos e para facilitar sua leitura e busca por temas de seu interesse, eles estão organizados em 8 capítulos que abordam a educomunicação a partir do fazer das crianças e da apropriação da produção midiática. Expressão artística, rádio, vídeo, jornalismo, cultura digital, redes sociais entre outros são os temas abordados pelos autores destes trabalhos. convidamos o leitor a mergulhar nesta jornada educomunicativa, vivendo e revivendo junto conosco essas experiências vividas por outros, refletindo em cada texto sobre como estamos, como evoluímos e como seguimos os passos daqueles que com sua ousadia, amor e luta elaboraram os fundamentos da educomunicação