Бактерії порядку Chlamydiales у зразках від свиней з репродуктивними розладами. Виявлення Waddlia chondrophila у свиней

Chlamydial infections cause significant economic expenses due to infertility, insufficient productivity growth, and high mortality rates among young stock. Bacteria of the Chlamydiaceae family (Chlamydia suis Chlamydia abortus, Chlamydia psittaci and Chlamydia pecorum) are well known pathogens isolated from pigs. The diseases associated with these species are widely studied; monitoring and prevention are carried out. However, chlamydia-related bacteria in swine remain poorly studied in Ukraine. The purpose of the study was to check samples, taken from swine from private farms in the Poltava region, Ukraine, for the presence of Chlamydia-like organisms. Determination of the possibility of coinfection of Chlamydia and Chlamydia-like organisms. We examined 28 samples from two private farms in the Poltava region (23 samples from sows, and 5 samples from boars). The studies were carried out using PCR with primers designed in our laboratory. As a result of the study, Chlamydiaceae-positive samples were not detected among sows. Along with it, 2 out of 5 samples taken from boars were found to be Chlamydiaceae-positive. The total number of Chlamydiaceae-positive samples was 2 out of 28 (7.14%). The total number of Waddlia-positive samples was 8 out of 28 (28.7%). A mixture of Chlamydiaceae and Waddlia chondrophila infection was found in one sample. Parachlamydia acanthamoebae was not found in any sample. There are no reports of the detection of Waddlia chondrophila in samples from swine in the sources available for us, so this publication might be the first such report. Due to the fact that W. chondrophila was first detected in the samples selected from pigs, the experiment was repeated three times, and the identity of the PCR product of W. chondrophila-positive samples was additionally verified by restriction analysis. Relatively small number of samples, in our research as well as in previous studies, does not allow us to make accurate calculations about the prevalence of chlamydia-like organisms in swine. Further research are required and might include broader sampling, isolation of the pathogen, sequencing of its genome, experimental infection, determination of pathomorphological changes. All the listed above, would help to determine significance of the study along with the role of W. chondrophila in chlamydia infection in swine.Хламідійні інфекції є причиною значних економічних втрат, зумовлених непліддям, недоотриманням приплоду, зниженням продуктивності, високою смертністю молодняка. Бактерії родини Chlamydiaceae (Chlamydia suis Chlamydia abortus, Chlamydia psittaci та Chlamydia pecorum), що найчастіше виділяють від свиней, широко вивчаються, проводиться моніторинг та профілактика захворювань. Проте хламідіє-споріднені бактерії у свиней залишаються мало вивченими. Метою цього дослідження було з’ясувати стан щодо хламідійної інфекції в умовах одноосібних селянських та фермерських господарств Полтавської області, а також спростувати чи підтвердити наявність хламідіє-подібних організмів у зразках, відібраних від свиней, та можливість конфекції Chlamydiaceae та хламідіє-подібних організмів. З цією метою було досліджено 28 зразків з двох одноосібних фермерських господарств Полтавської області. Дослідження проводилися методом ПЛР з використанням праймерів власного дизайну. В результаті дослідження Chlamydiaceae-позитивних зразків серед відібраних у свиноматок виявлено не було, проте 2 з 5 зразків, взятих у кабанів, виявилися Chlamydiaceae-позитивними. Загальна кількість Chlamydiaceae-позитивних серед відібраних проб становила 2 з 28 (7,14%). Загальна кількість Waddlia- позитивних зразків становила 8 з 28 (28,7%). P. acanthamoebae не виявлено у жодному зразку. В одному зразку виявлено конфекцію Chlamydiaceae та W. Сhondrophila. В зв’язку з тим, що W. сhondrophila у зразках, відібраних від свиней, нами була виявлена вперше, дослід було повторено триразово, а ідентичність ПЛР-продукту W. сhondrophila-позитивних проб додатково було перевірено рестрикційним аналізом. Порівняно невелика кількість зразків як у нашому дослідженні, так і в попередніх дослідженнях не дозволяє нам зробити точні розрахунки щодо поширеності хламідієподібних організмів у свиней. Потрібні подальші дослідження, які повинні включати ширшу вибірку, виділення збудника, секвенування його геному з подальшим його аналізом, проведення експериментальних заражень тварин з визначенням патоморфологічних змін. Все перераховане вище допоможе визначити значущість даної знахідки та визначити роль W. chondrophila для свинарства

ПЛР-тест-система видової ідентифікації Parachlamydia acanthamoebae

Chlamydia-like bacteria Parachlamydia acanthamoebae belongs to the phylum Chlamydiae, class Chlamydiia, order Chlamydiales, family Parahlamydiaceae, genus Parachlamydia. The following terms were introduced to designate Chlamydiales bacteria that are not members of the Chlamydia genus: Chlamydia-related bacteria – CRB, Chlamydia-like bacteria and Chlamydia-like organisms – CLOs. Parachlamydia acanthamoebae is associated with respiratory diseases in humans and ruminants, as well as diseases of the reproductive organs leading to abortions, or the birth of weak or non-viable offspring. Unfortunately, there are no such test systems in the arsenal of humane and veterinary medicine of Ukraine, which could identify and differentiate Сhlamydia-related organisms, Parachlamydia acanthamoebae in particular. In this regard, PCR test system has been developed for the identification and species differentiation of Parachlamydia acanthamoebae, the bacteria of the Parachlamydiaceae family, which is the causative agent of chlamydiosis in ruminants and humans. Conducted bioinformatics studies revealed species-specific regions of the Parachlamydia acanthamoebae genome, which were used to develop the nucleotide structure of oligonucleotide primers, which allow to amplify the DNA fragment of the 16S rRNA gene specific for the bacterium Parachlamydia acanthamoebae, the size of 88 base pairs. Verification of the analytical specificity of the PCR test system was confirmed by amplifying 9 control DNA of members of the order Chlamydiales: Waddlia chrondophila, Clavochlamydia salmonicola, Piscichlamydia salmonis, Chlamydia avium, Chlamydia pecorum, Chlamydia abortus, Chlamydia psittaci, Chlamydia suis, Chlamydia caviae. The demand for such test systems is due not only to their use in scientific research to isolate and study individual strains, to conduct epizootic monitoring, but also for the purpose of effective treatment, since distinct species have diverse sensitivity or even insensitivity to different types of antibiotics and vary in the source of infection and mode of transmission.Хламідієподібний організм Parachlamydia acanthamoebae належить до типу Chlamydiae, класу Chlamydiia, порядку Chlamydiales, pодини Parahlamydiaceae, роду Parachlamydia. Терміни: хламідієспоріднені бактерії (Chlamydia-related bacteria – CRBs), хламідіє-подібні бактерії (Chlamydia-like bacteria,) та хламідієподібні організми (Chlamydia-like organisms – CLOs) ввели для позначення бактерій, що входять до порядку Chlamydiales, але не є представниками роду Chlamydia. Parachlamydia acanthamoebae пов’язують з респіраторними захворюваннями людини і жуйних, а також хворобами репродуктивних органів, що призводять до абортів або ж до народження кволого чи нежиттєздатного потомства. На жаль, в арсеналі гуманної та ветеринарної медицини України не існує таких тест-систем, які б могли виявити і диференціювати хламідіє-споріднені організми, зокрема Parachlamydia acanthamoebae. У зв’язку з цим, було розроблено ПЛР-тест-систему для ідентифікації та видової диференціації Parachlamydia acanthamoebae, бактерії родини Parachlamydiaceae, збудника хламідіозів жуйних та людини. Біоінформаційні дослідження виявили видоспецифічні ділянки геному Parachlamydia acanthamoebae, які було використано для розроблення нуклеотидної структури олігонуклеотидних праймерів, що дозволяють ампліфікувати фрагмент ДНК гену 16S рРНК, специфічний для бактерії Parachlamydia acanthamoebae, розміром 88 пар нуклеотидів. Перевірка аналітичної специфічності ПЛР-тест-системи підтверджена шляхом ампліфікації контрольної ДНК 9 видів бактерій, що входять до порядку Chlamydiales: Waddlia chrondophila, Clavochlamydia salmonicola, Piscichlamydia salmonis, Chlamydia avium, Chlamydia pecorum, Chlamydia abortus, Chlamydia psittaci, Chlamydia suis, Chlamydia caviae. Необхідність таких тест-систем обумовлена не тільки можливістю їх використання в наукових дослідженнях з метою виділення і вивчення окремих штамів, проведення епізоотичного моніторингу, а й з метою ефективного лікування, оскільки різні види мають різну чутливість або навіть нечутливість до різних видів антибіотиків та різняться джерелом інфекції і шляхами передачі

ПЛР-тест для ідентифікації та видової диференціації Waddlia chondrophila

In recent times, the number of species of chlamydia associated with a number of inflammatory diseases in animals has expanded considerably. Moreover, in addition to chlamydia, attention was attracted by Сhlamydia-like organisms, which are not only dangerous for animals, but also carry a zoonotic threat. Currently, the most studied Chlamydia-like organisms are Waddlia chondrophila and Parachlamydia acanthamoebae. They are associated with diseases of the reproductive and respiratory systems in cattle and humans. Considering the danger to animals and the zoonotic threat of chlamydia-like organisms along with the absence of tools to discover them in Ukraine, the aim of our work was to develop a PCR test for the identification and species differentiation of Waddlia chondrophila. Conservative 16S rRNA genes were chosen as target genes for developing a PCR test system for identifying Waddlia chondrophila. Primers were selected specifically to be able to create multiplex combinations with the previously developed PCR test for Parachlamydia acanthamoebae. Both primers were designed with the same physical characteristics to provide simultaneous amplification under the same conditions in single or multiplex PCR. For the specificity evaluation of the primers, a panel of following DNA samples was used: Waddlia chondrophila, Parachlamydia acanthamoebae, Chlamydia avium, Chlamydia pecorum, Chlamydia abortus, Chlamydia psittaci, Chlamydia suis, Chlamydia caviae, Clavochlamydia salmonicola, Piscichlamydia salmonis. PCR product of 88 base pairs (b.p.) was formed during amplification only when the Waddlia chondrophila control DNA was present in the sample, as was expected. The small size of the PCR product theoretically allows the use of this pair of oligonucleotide primers for real-time PCR tests. After testing on clinical samples, developed PCR test system for identifying and species differentiation of Waddlia chondrophila can be used by scientists for extensive monitoring, by veterinary medicine doctors to clarify the diagnosis, and might be introduced into the practice of laboratories of veterinary and humane medicine.Останнім часом кількість видів хламідій, пов’язаних з рядом запальних захворювань тварин, значно розшилась. Більш того, окрім хламідій, увагу привернули хламідіє-подібні організми, які не тільки є небезпечними для тварин, але й несуть зоонозну загрозу. Найбільш вивченими, на даний момент хламідіє-спорідненими організмами є Waddlia chondrophila та Parachlamydia acanthamoebae, їх пов’язують з захворюваннями репродуктивної та респіраторної систем великої рогатої худоби та людини. З огляду на небезпечність для тварин і зоонозну загрозу хламідіє-подібних організмів та відсутністю доступного способу їх дослідження метою нашої роботи стало розроблення ПЛР – тесту для ідентифікації і видової диференціації Waddlia chondrophila. При розробці ПЛР – тест система для виявлення Waddlia chondrophila в якості генів-мішеней були обрані консервативні гени 16S pРНК. Праймери підбиралися таким чином, щоб була можливість створення мультиплексних поєднань з раніше розробленою нами ПЛР-тест-системою з Parachlamydia acanthamoebae. Ці праймери були розроблені з однаковими фізичними характеристиками, щоб мати можливість забезпечити одночасну ампліфікацію в однакових умовах в одиночних або мультиплексних ПЛР. Для оцінки специфічності праймерів використовувалася панель зразків ДНК: Waddlia chondrophila, Parachlamydia acanthamoebae, Chlamydia avium, Chlamydia pecorum, Chlamydia abortus, Chlamydia psittaci, Chlamydia suis, Chlamydia caviae, Clavochlamydia salmonicola, Piscichlamydia salmonis. Праймери давали продукт ПЛР 123 пари нуклеотидів (п.н.) тільки тоді, коли у зразку була присутня контрольна ДНК Waddlia chondrophila, як і очікувалося. Незначний розмір ПЛР-продукту теоретично дозволяє використовувати дану пару олігонуклеотидних праймерів і для ПЛР-тестів в реальному часі. Розроблена ПЛР тест-система для ідентифікації та видової диференціації Waddlia chondrophila після апробації на клінічному матеріалі може бути використана вченими для широкого моніторингу, використовуватись лікарями ветеринарної медицини для уточнення діагнозу, бути введеними в практику лабораторій ветеринарної медицини та гуманної медицини