The Outer Vestibule of the Na+ Channel–Toxin Receptor and Modulator of Permeation as Well as Gating

The outer vestibule of voltage-gated Na+ channels is formed by extracellular loops connecting the S5 and S6 segments of all four domains (“P-loops”), which fold back into the membrane. Classically, this structure has been implicated in the control of ion permeation and in toxin blockage. However, conformational changes of the outer vestibule may also result in alterations in gating, as suggested by several P-loop mutations that gave rise to gating changes. Moreover, partial pore block by mutated toxins may reverse gating changes induced by mutations. Therefore, toxins that bind to the outer vestibule can be used to modulate channel gating

A molecular switch between the outer and the inner vestibule of the voltage-gated Na+ channel

Spannungsabhängige Na+ Kanäle sind porenbildende, membranständige Makromoleküle, die den Fluß von Na+ Ionen über die Zellmembran ermöglichen. Sie ermöglichen die rasche Depolarisation von Zellmembranen und damit die Weiterleitung von Erregungsimpulsen zwischen einzelnen Zellen. Somit sind diese Moleküle grundlegend an der Funktion der Muskulatur und des Nervensystems beteiligt. Bis heute existiert keine Kristallstruktur des spannungsabhängige Na+ Kanals, sodass sich unsere Vorstellung von der räumlichen Struktur dieses Moleküls weitgehend an Homologien mit bereits kristallisierten Strukturen von Kaliumkanälen orientiert. Dementsprechend bestehen spannungsabhängige Na+ Kanäle aus einer -, und 1 bis 4 akzessorischen ß Untereinheiten. Die - Untereinheit wird aus 4 Domänen gebildet, die sich symmetrisch um die zentrale Pore gruppieren. Jede Domäne setzt sich aus 6 transmembransegmente (Helices S1- S6) zusammen. Die S6 Segmente aller 4 Domänen begrenzen die Pore wobei sich jeweils eine Schleife zwischen den S5 und S6 Segmenten von extrazellulär in die Pore faltet und das äussere Vestibulum bildet ("P-Loop"). Die Aminosäuren am inneren Umkehrpunkt der P-Loops bilden den Seletivitätsfilter des Kanals. Ein molekulares Homologiemodell des spannungsabhängigen Na+ Kanals legt eine enge räumliche Beziehung des Selektivitätsfilters mit dem angrenzenden S6 Segmenten, die das innere Vestibulum begrenzen, nahe. Ziel meiner Arbeit war es, funktionelle Belege für eine solchen engen Zusammenhang zwischen dem äusseren und dem inneren Vestibulum zu sammeln. Dazu bediente ich mich einer besonderen Konformationsänderung des Kanals, die wir als "ultra-langsame Inaktivierung" bezeichnen. Spannungsabhängige Ionenkanäle können grundsätzlich drei Konformationen eingehen: Im geschlossenen Zustand sind die Kanäle nicht-leitend, können aber aktiviert werden. Im "offenen Zustand" werden Ionenströme geleitet. Der "inaktivierte Zustand" schließlich ist wieder nicht-leitend, zum Unterschied zum geschlossen Zustand können die Kanäle aber nicht aktiviert werden. Dazu müssen die Kanäle in den geschlossenen Zustand übergeführt werden, ein Vorgang den wir als "Erholung von der Inaktivierung" bezeichnen. Die Grundlage dieser spannungsabhängigen Zustandsänderungen dürfte das Öffnen und Schließen spezifischer Tore ("gates") sein. Allerdings scheint es eine größere Zahl von "inaktivierten" Zuständen (und "gates") mit unterschiedlich schnelle Kinetik zu geben. Mutationsstudien legen nahe, dass das Gate für die "schnelle Inaktivierung" im intrazellulärem Linker zwischen den Domänen III und IV lokalisiert ist. Ein Verschluss der inneren Kanalpore durch dieses Tor dürfte der schnellen Inaktivierung zugrunde liegen. Die Zeitkonstante für das Eintreten in - und Erholung von der schnellen Inaktivierung liegt in der Grössordnung von Millisekunden. Abgesehen von schneller Inaktivierung gibt es auch eine Reihe von langsameren Inaktivierungsphasen. Bei sehr langen Depolarisierungen, in der Grössordnung von mehreren Minuten treten rNaV1.4-Kanäle (Skelettmuskel Isoform der adulten Ratte) in eine sehr stabile inaktivierungsphase, die sogenannte "ultralangsame" Inaktivierung (IUS) ein. Im Gegensatz zur "schnellen Inaktivierung" ist der molekulare Mechanismus langsamer Inaktivierungszustände weitgehend unbekannt. Wir konnten zeigen, dass eine Mutation am Seletivitätsfilter von rNav 1.4 Kanälen, K1237E, die Wahrscheinlichkeit des Eintritts in die IUS drastisch erhöht. Eine konformationsänderung des äusseren Vestibulums könnte daher zu dieser kinetischen Phase führen. Andererseits bindet das Lokalanästhetikum Lidocain an den inneren Teil der Kanalpore und inhibiert den Eintritt in die IUS durch einen "foot-in-the-door" -Mechanismus. Daher scheint eine Konformationsänderung des inneren Vestibulums (i.e. des DIV-S6 Segments) bei der Entstehung des IUS Zustandes beteiligt zu sein. Um die relative Rolle des inneren- und des äusseren Vestibulums bei der Entstehung der ultralangsamen Inaktivierung zu klären, untersuchten wir den Effekt von seriellen Mutationen des Domäne IV-S6 Segments im Hintergrund der K1237E Mutation. Wir fanden heraus, dass nur die Mutationen an der Position 1575 des Domäne IV-S6 Segments die Wahrscheinlichkeit des Eintritts in die IUS wesentlich vermindert und die Erholungsrate (Austreten) von der IUS bedeutsam beschleunigt. Position 1575 scheint daher eine Region der Wechselwirkung zwischen Domäne- III P-loop und DIV-S6 Segment zu sein. Zum ersten Mal bestätigen diese Daten ein molekulares Modell, in dem ein Teil des Selektivitätsfilters in enger räumlicher Beziehung zur Position 1575 des Domäne IV-S6 Segments liegt.Na+ channels permit rapid transmission of depolarizing impulses throughout cells and cell networks, and are essential to the proper function of skeletal muscle, the heart and the nervous system. Voltage gated Na+ channels consist of one pore forming  subunit, and of up to four accessory ß subunits. The selectivity filter of the channel is considered to be formed by the amino acids D400, E755, K1237, and A1529 ("DEKA" motif) which are located at the innermost turn of the P-loops connecting S5 and S6 segments of each domain. The inner vestibule is believed to be lined by four S6 helices, one from each domain. Comparison of crystal structures of K+ channels in open and closed states as well as electron paramagnetic resonance spectroscopic studies suggest that the activation gate of voltage-gated ion channels is located at the inner part of the S6 segments. This may also hold true for voltage-gated Na+ channels because mutations in S6 segments alter activation gating. The gate for fast inactivation of the channel has been mapped to the intracellular linker between domains III and IV. This intracellular loop is currently considered to produce channel inactivation by transiently occluding the intracellular vestibule of the channel. The time constants of entry into and recovery from fast inactivation are on the order of milliseconds. Apart from "fast inactivation" a number of slower inactivated states have been described. During very long depolarizations, on the order of several minutes, rNaV1.4 channels enter a very stable inactivated state which we refer to as "ultra-slow" inactivation (IUS). In these channels the likelihood of entry into IUS is substantially increased by a mutation in the selectivity filter, K1237E. IUS can be modulated by molecules binding to the outer vestibule, suggesting that a conformational change of the outer vestibule gives rise to this kinetic state. On the other hand, the local anesthetic drug lidocaine, which binds to the internal part of the channel pore, inhibits entry into IUS by a "foot-in-the-door" mechanism indicating that a conformational change of the inner vestibule generates the IUS state. In order to explain the involvement of both the outer and the inner vestibule in ultra-slow inactivation, we proposed a model in which the mutation K1237E produces a conformational change of the outer vestibule which is transmitted to the internal vestibule through the DIV- S6 segment. The resulting conformational change of the internal vestibule gives rise to the extremely stable IUS state. If this molecular mechanism holds true, then mutations at the location of interaction between the selectivity filter and the adjacent S6 segment should substantially modulate the ultra-slow inactivated state. A homology model of the voltage-gated Na+ channel, based on the crystal structure of the KcsA channel places the domain IV-S6 segment in close proximity to the domain III P-loop (containing the site 1237 which is essential for the generation of IUS)(Fig. 14A). In order to search for experimental evidence for an interaction site between the domain III P-loop and the internal vestibule we generated serial alanine and cysteine replacements of amino acids of the domain DIV- S6 segment in the background of the mutation K1237E. We find that mutations only at the site 1575 substantially decrease the likelihood of entry into IUS or significantly accelerate recovery from IUS, suggesting that this residue represents an interaction site between the domain III p-loop and the domain IV- S6 segment. For the first time these functional data confirm a molecular model in which the turn of the domain III P-loop is in close relationship with the domain IV- S6 segment at the level of I1575.submitted by Touran ZarrabiAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2010OeBB(VLID)188335