Molecular staging by multiplex PCR of prostate cancer

Metastatic disease is the most common cause of cancer-related death in patients with prostate cancer. A considerable body of evidence indicates that tumor cells are shed from a primary tumor mass at the earliest stages of malignant progression. Some of these cells, will travel via the peripheral blood to sites anatomically distant from the primary tumor and form metastases. The cells that escape from the primary tumor and settle down at a secondary site to cause metastasis are called Circulating Tumor Cells (CTCs). These cells are understood to be a source of eventual lethal metastases, the major cause of treatment failure in cancer patients. Detection of CTCs in cancer patients holds tremendous “promise” in terms of identifying the potential for metastatic disease at very early stages, managing risk stratification in the adjuvant setting, monitoring response to treatment and disease recurrence, and the prospective development of more effective and better tailored anticancer therapies for individual patients based on molecular characterization of CTCs. A vast plethora of research studies have concluded that the presence of CTCs in the peripheral blood is of prognostic significance in different types of solid tumors. Furthermore, when the limitations of traditional parameters, such as, PSA value, GS, and clinical stage are considered, it became evident that additional markers are urgently needed to improve the accuracy of outcome prediction after definite treatment, especially in high-risk prostate cancer. Multiplex PCR is a mature variant of PCR in which more than one locus are simultaneously amplified in the same reaction by including more than one pair of primers. The main purpose of this research was to develop a multiplex RT-PCR assay, for the first time, which enables the stimultaneous detection at the peripheral blood, of three prostate cancer specific nucleic acid and two biomarkers associated with malignancies, and to validate this technique as an auxiliary method in the clinical staging of prostate cancer patients. The study panel consisted of 5 mRNA tumor markers: prostate specific antigen (PSA), prostate specific membrane antigen (PSMA), prostate stem cell antigen (PSCA), parathyroid hormone-related protein (PTHrP), and cytokeratin 19 (CK19), all shown previously to be significantly expressed in prostate cancer. In conclusion, after the successful development of this technique, it could be said that the results of this study demonstrate the superiority of Multiplex RT-PCR compared to individual marker expression analysis, and could provide a new, clinical tool to complement the existing PSA tests and improve prostate cancer clinical staging modalities.Η διασπορά της νεοπλασματικής νόσου είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους ασθενείς με καρκίνο προστάτη. Νεότερες αποδείξεις συνηγορούν ότι τα καρκινικά κύτταρα διασπείρονται σε αρχικά στάδια εξέλιξης της νόσου. Κάποια εξ’ αυτών των κυττάρων μεταναστεύουν αιματoγενώς για να αποικίσουν σε απομακρυσμένες ανατομικά θέσεις από τον πρωτοπαθή όγκο και να δώσουν μεταστάσεις. Τα κύτταρα που διαφεύγουν από τον πρωτοπαθή όγκο σε δευτερογενείς εστίες για να προκαλέσουν μεταστάσεις καλούνται κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα. Aυτά τα κύτταρα είναι η πηγή των αναπόφευκτα θανατηφόρων μεταστάσεων, που αποτελεί την κύρια αιτία αποτυχίας της θεραπείας σε ασθενείς με καρκίνο. Η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο, αποτελεί μια αισιόδοξη «υπόσχεση» αναφορικά με την έγκαιρη αναγνώριση του ενδεχομένου ανάπτυξης μεταστατικής νόσου ήδη από τα αρχικά στάδια, την κατηγοριοποίηση των ασθενών με βάση το ρίσκο υποτροπής, την παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία, την εκτίμηση της βιοχημικής υποτροπής της νόσου, και την μελλοντική ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών, καλύτερα στοχευμένων, εξατομικευμένων, αντικαρκινικών θεραπειών βασισμένων στα μοριακά χαρακτηριστικά τους. Μια πληθώρα ερευνητικών μελετών υποστηρίζει ότι η παρουσία κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα, έχει προγνωστική σημασία σε διάφορους καρκίνους επιθηλιακής προελεύσεως. Επιπρόσθετα, όταν λαμβάνονται υπόψη οι περιορισμοί των παραδοσιακών παραμέτρων, όπως η τιμή του ειδικού προστατικού αντιγόνου στον ορό, η τιμή κατά Gleason, και το στάδιο, γίνεται ολοφάνερο ότι επιπρόσθετοι δείκτες απαιτούνται άμεσα για να βελτιωθεί η ακρίβεια πρόβλεψης της έκβασης της νόσου μετά από συγκεκριμένη θεραπεία, ειδικά στους ασθενείς με καρκίνο προστάτη και με υψηλό ρίσκο υποτροπής. Η πολλαπλή αντίδραση πολυμεράσης (Multiplex PCR) αποτελεί την πιο εξελιγμένη τεχνολογικά εκδοχή της κλασσικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), κατά την οποία πολλαπλασιάζονται ταυτόχρονα στην ίδια αντίδραση περισσότερα από ένα τμήματα γονιδίων με την χρήση περισσότερων ζευγών εκκινητών στην ίδια αντίδραση. Ο κύριος σκοπός της έρευνας αυτής ήταν η ανάπτυξη για πρώτη φορά, ενός πειραματικού πρωτοκόλλου πολλαπλής αντίδρασης πολυμεράσης, το οποίο δύναται να πολλαπλασιάσει τρία ειδικά του καρκίνου του προστάτη γονίδια-δείκτες και δύο γονίδια-δείκτες σχετιζόμενα γενικά με κακοήθεια, και να εξεταστεί η τεχνική αυτή σαν βοηθητική μέθοδος στην κλινική σταδιοποίηση του καρκίνου του προστάτη. Τα γονίδια που περιλήφθηκαν στην μελέτη ήταν 5 mRNA καρκινικοί δείκτες: το ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA), το ειδικό προστατικό μεμβρανικό αντιγόνο (PSMA), το ειδικό προστατικό αντιγόνο των αρχέγονων προστατικών κυττάρων (PSCA), το πεπτίδιο που ομοιάζει την παραθορμόνη (PTHrP), και η κυτοκερατίνη 19 (CK19), που έχουν αποδειχτεί προηγουμένως να εκφράζονται σημαντικά στον καρκίνο του προστάτη. Συμπερασματικά, μετά την επιτυχημένη ανάπτυξη αυτής της τεχνικής, για πρώτη φορά διεθνώς,, προκύπτει από το αποτέλεσμα της παρούσας διατριβής η υπεροχή της πολλαπλής αντίδρασης πολυμεράσης (Multiplex PCR) συγκριτικά με την επιμέρους ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων-δεικτών, κάτι που θα μπορούσε ενδεχομένως να συμπληρώνει το υπάρχον τεστ ειδικού προστατικού αντιγόνου στον ορό, και έτσι να βελτιώνει καθοριστικά τους υπάρχοντες τρόπους κλινικής σταδιοποίησης του καρκίνου του προστάτη

Detection of Circulating Tumor Cells in Prostate Cancer Patients: Methodological Pitfalls and Clinical Relevance

Disseminated malignancy is the major cause of prostate cancer–related mortality. Circulating tumor cells (CTCs) are essential for the establishment of metastasis. Various contemporary and molecular methods using prostate-specific biomarkers have been applied to detect extraprostatic disease that is undetectable by conventional imaging techniques, assessing the risk for disease recurrence after therapy of curative intent. However, the clinical relevance of CTC detection is still controversial. We review current literature regarding molecular methods used for the detection of CTCs in the peripheral blood and bone marrow biopsies of patients with prostate cancer, and we discuss the methodological pitfalls that influence the clinical significance of molecular staging