ヒト胃癌の腹膜播種モデルをもちいた新治療法の開発

金沢大学医学部・附属病院我々が樹立した高度腹膜転移胃癌株MKN-45-Pを用いて腹膜播種の分子機構の解明、新治療法の開発を行った。平成11-12年度の研究で腹膜播種は原発巣漿膜から離脱した腹腔内遊離癌細胞が3種類の転移経路を経て形成されることを明らかにした。すなわち、遊離癌細胞の転移経路として乳班や横隔膜にあるリンパ管基始(小孔、stomata)から中皮下リンパ腔に進入する経リンパ行性転移、腹膜に直接接着する経腹膜転移及び卵巣転移の3経路である。経リンパ行性転移では脈管外通液路としての生理的な腹腔内液の流れにのり癌細胞がリンパ腔に達するので早期に転移が完成する。リンパ腔内に進入したあとは経腹膜転移と同じ過程で播種が形成される。さらに経腹膜転移は以下に述べる多段階的な経過を経て形成される。1)腹膜中皮に接着,2)サイトカインによるクロストークで中皮、内皮が収縮,基底膜が露出,3)基底膜に癌細胞が強く接着,4)中皮下間質へ浸潤,5)癌の増殖と血管、間質の誘導で播種が完成する。この過程がとどこうりなく進行するにはおのおのの過程の成立に必要な分子が多段階的に発現されなければならない。特に重要な分子として、接着因子(E-cadherin,Integrin)、運動因子(AMF/AMFR,HGF/MET,MTS1)、マトリックス分解酵素(MMP7,MT1-MMP,urokinase,とその受容体)、血管・リンパ管増殖因子(VEGF,VEGF-C)などが同定された。このようにして完成された腹膜播種は複数の転移関連遺伝子が同時に発現している。したがって単一の分子を標的とした治療では腹膜播種を抑えることはできない。そこで複数の転移関連遺伝子,(c-met,integrin,VEGFなど)の転写因子であるc-etsの発現をアンチセンスDNAで制御するとヌードマウス腹膜播種がコントロールできた。また、新規制癌剤エチニルシチジン、CNDAC(デオキシチジン誘導体)の腹腔内投与により腹膜播種モデル動物の生存率が有意に改善された。以上より将来複数の遺伝子を同時に制御する遺伝子治療が必要と考えられた。複数の腹膜播種関連遺伝子の転写因子であるc-etsを制御する方法は有望な戦略の一つになると推測された。またデオキシチジン誘導体の腹腔内投与は近い将来臨床応用できるであろう。研究課題/領域番号:11877210, 研究期間(年度):1999 – 2000出典：研究課題「ヒト胃癌の腹膜播種モデルをもちいた新治療法の開発」課題番号11877210（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11877210/）を加工して作

膵ランゲルハンス島B細胞の再生能および再生促進因子に関する研究

金沢大学医学部1.90%膵切除を行ったラットにポリ(ADP-リボ-ス)合成酵素阻害剤である3-3アミノベンザマイド(AB)を0.1g/kg連日腹腔内投与し、糖尿病発症の抑制効果とその機構を検討した。生食のみを投与したラットは術後90日目に82%に糖尿病が発症したのに対し、ABを投与したラットではその発症率が27%と低下した。ABを投与したラットでは残存率のラ氏島は著明に肥大し、B細胞の体積は3.5倍にまで増生していた。3Hチミジンのオ-トラジオグラフィ-ではB細胞の標識指数はAB投与による影響を受けず、術後3、5日目に3%前後の高値を示し以後徐々に低下した。以上よりABは膵切除後に増生したB細胞の機能を保持することにより膵大量切除後の糖尿病発症を抑制するものと考えられた。2.90%膵切除ラットに対しポリ(AD-リボ-ス)合成酵素阻害剤である3-アミノベンザマイド(AB)を0.1g/kg連日腹腔内投与しB細胞再生効果についてオ-トラジオグラフィ-およびstathmokinetic studyにより検討した。生食のみを投与したラットでは術後30日目のラ島は高度に萎縮し、細胞減少を認めたが、ABを投与したラットではラ島は肥大し、B細胞の過形成を認めた。オ-トラジオグラフィ-およびstathmokinetic studyの結果、ABを投与した群でB細胞のlabeling indexおよびmitotic indexの増加を認めた。以上より、ポリ(ADP-リボ-ス)合成酵素阻害剤は、大量切除後の残存B細胞に対して増殖促進効果があると考えられた。1.3-Aminobenzamide as poly(ADP-ribose) synthetase inhibitor was given to 90% depancreatized rats. The regenerative activities of B cells were examined in attempt to clarify the mechanism of preventing surgical diabetes. On the 30th day after pancreatectiay, the islets treated with saline were reduced and the number of B cells decreased. In deparcreatized and 3-aminobenzomide treated rat (AB), the islets were enlarged and hyperplasia of B cells was seen. Autoradiography and stuthwokinetic studies showed labeling and mitotic indices of B cells in AB had a higher level than those of saline group. These results suggest that poly(ADP-ribose) synthetuse inhibitor can induce self-replication of B cells in partially depancreated rats.2. While the onset of diabetic state was observed in 82% of depancreatized rats without 3-aminobenzaamide, 29% of 3-aminobenzamide treated rats fell into diabetic state the morphologic examination of remnant pancreas revealed the islets from 3-AB-treated rats were enlarged. The percentage of labelled B cells reached a peak in the rats killed 3 and 5 days after operation, and then declined gradually, the results indicate that 3-AB may prevent diabetes mellitas in partially depancreatized rats by maintaining the function of B cells.研究課題/領域番号:61570641, 研究期間(年度):1986 – 1988出典：研究課題「膵ランゲルハンス島B細胞の再生能および再生促進因子に関する研究」課題番号61570641（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-61570641/615706411989kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

インスリン産生細胞増殖因子Reg蛋白質を用いた糖尿病治療法の開発

金沢大学医学部附属病院本研究の目的は、申請者らが発見したインスリン産生細胞の新しい増殖因子Reg蛋白の作用機序を明らかにし、組換えReg蛋白を用いてインスリン産生細胞を再生・増殖させるという糖尿病治療法開発への道を開くことである。平成8年度の研究は、当初計画通り順調に進行し、以下の成果を得た。1.ES細胞染色体上での相同組換えの手法を用いてReg遺伝子欠損マウスを作製することに成功した。(1)染色体上の遺伝子が変異Reg遺伝子と入れ換わったES細胞株をマウス胞胚に注入して代理母に移入したキメラ個体を得た。(2)(1)で得られたキメラマウスの交配を行ない、Reg遺伝子欠損マウスを得た。2.ヒト及びマウスのReg遺伝子ファミリーの遺伝子座を決定した。(1)ヒトREG遺伝子ファミリー(REGIα,REGIβ,HIP/PAP,RS)の遺伝子座の決定をFISH法およびYACクローンの解析により行ったところ、当該遺伝子ファミリーが全て第2番染色体p12に存在し、セントロメア側からHIP/PAP-RS-REGIα-REGIβの順序で並んでいることが明らかとなった。(2)マウスReg遺伝子ファミリー(RegI,RegII,RegIIIα,RegIIIβ,RegIIIγ)の遺伝子座をFISH法により解析したところ、当該遺伝子ファミリーが全て第6番染色体上の極めて近接した領域に存在していることが明らかになった。3.平成7年度に作製したReg蛋白過剰発現マウスの解析を行った。Reg蛋白過剰発現マウスの膵β細胞の形態、大きさは正常マウスとほとんど変わらなかったが、Reg蛋白過剰発現マウスから分離した膵ランゲルハンス島は正常マウス膵ランゲルハンス島と比較して15〜3倍のDNA合成を示し、Reg蛋白の過剰発現によりβ細胞の増殖能が上昇することが明らかにされた。研究課題/領域番号:07557013, 研究期間(年度):1995 – 1997出典：研究課題「インスリン産生細胞増殖因子Reg蛋白質を用いた糖尿病治療法の開発」課題番号07557013（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07557013/）を加工して作

ヒト胃癌の腹膜播種のモデルの確立とその応用

金沢大学医学部附属病院平成9-10年度は胃癌継代培養株MKN-45から高度腹膜転移株MKN-45-Pを樹立することに成功した。この株において特異的に発現している遺伝子を35種類の特異primersをもちいRT-PCRでスクリーニングした。その結果この細胞株では接着因子ではintegrin a2 a3.b1、マトリックス分解酵素ではMMP-7,MT1-MMP,ウロキナーゼ受容体、MMP-11,運動因子ではc-met,AMF receptorが過剰発現していることを確認した。このうちintegrin a2 a3.b1とMMP-7は転移能が上がるにしたがい発現が亢進することがわかった。まず、マトリゲルをコートしたシャーレ上で抗integrin a2 a3抗体で処理したMKN-45-Pを培養すると、マトリゲルとの接着数が対照に比べて有意に低下した。さらに大網から分離した中皮上で同様な実験をすると、同じように抗体処理により癌細胞の接着は抑制された。これを相差電子顕微鏡で観察すると癌細胞は中皮の開裂部でマトリゲルが露出している部分に選択的に接着していた。integrin a2, a3はマトリゲルの構成成分であるラミニン、コラーゲンのレセプターであり、integrin b1と2重鎖(VLA-2.-3)を形成することで細胞外マトリックスと細胞の強固な結合を誘導する。したがって、この高度転移株では細胞表面に過剰に発現したVLA-2,-3を介して腹膜に強く結合するものと考えられる。またヌードマウス腹腔内に抗integrin a2,a3抗体で処理したMKN-45-Pを107個注入すると明らかに生存期間が延長した。このように腹腔内に遊離した癌細胞が腹膜に最初に接着する段階でVLA-2,-3が重要な役割をもっていることが明らかとなった。この成績の一部は著書Peritoneal Dissemination(Maeda Shoten.ED.Y Yonemura.1998)に記載した。腹膜に接着した癌細胞は腹膜下10-20mmに分布する毛細血管にまで浸潤しなければ増殖することができない。この腹膜と毛細血管の間の組織はblood-peritoneal barrierとよばれており、浸潤能の低い癌細胞では血管周囲まで到達できないのでそのまま死滅してしまう。癌の浸潤能はマトリックス分解能と運動能の両機能に依存している。MKN-45-Pではマトリックス分解酵素ではurokinase receptor,MMP-11,urokinase,MT1-MMP,MMP-7が、運動因子ではc-met.AMFRが過剰発現していた。このうちurokinase receptor,MMP-11,urokinase,MT1-MMP,c-met,AMFRは親株であるMKN-45でも過剰発現していた。一方、MMP-7は転移能の上昇とともに発現が亢進していた。そこで、MMP-7 mRNAの第4exonの最初の翻訳部位に相補的な16merのphosphorothioate型antisense oligonucleotides(MMP-7-specific antisense(AS-1)oligonucleotides(5´-GTATATGATACGATC-3´)and random comtrol(CL-1)oligonucleotides(5´-GTATTAGTATCGAAC-3´)を作成し、MKN-45-Pと24時間培養後、マトリゲル内への浸潤能を検討した。antisense oligo.(10mM)処理により癌細胞の浸潤能は有意に低下した。その抑制率は対照の95%であった。またWestern blotでMMP-7蛋白の発現は45%低下し、RT-PCRでもMMP-7mRNAは著名に抑制された。このantisense oligo.(10mM)はMKN-45-Pの増殖に全く影響を及ぼさなかった。そこでヌードマウス腹腔内にMMP-7 antisense oligo.(10mM)(MMP-7-specific antisense(AS-1)oligonucleotides(5´-GTATATGATACGATC-3´)and random comtrol(CL-1)oligonucleotides(5´-GTATTAGTATCGAAC-3′)で24時間処理したMKN-45-Pを投与し生存率を比較した。しかしながら、MMP-7 antisense oligo.は生存率を改善させなかった。これはこの高度転移株がMMP-7以外の細胞外マトリックス分解酵素であるurokinase.MMP-11.MTl-MMPを同時に産生しているからであると考えられた。また、AMFRに対するphosphorothioate型 antisense oligonucleotides(5\u27-CGCTGTCTCTCATCAGCA-3´)およびsense oligo.(5\u27-ACGACTACTCTCTGTCGC-3\u27)を作成し、同様な方法でMKN-45-Pを処理しマトリケル上で培養した。その結果、AMFR antisense oligo.(10mM)は有意に癌細胞のマトリゲル内の浸潤能を抑制した。To clarify the molecular mechanisms of the formation of peritoneal dissemination, a highly metastatic cell line, named MKN-45-P was established from gastric cancer cell line of MKN-45 by repeat intraperitoneal inoculation of free cancer cells in ascites. Intraperitoneal inoculation of 1O^7 cells of this cell line can reproduce peritoneal dissemination with bloody ascites. Screening of metastasis related genes, which are expressed from this cell line was performed using specific primers. Among more than 30 metastasis related genes, MKN-45-P expressed MMP-7, MMP-l1, urokinase type plasminogen activator, and its receptor, MTl-MMP, integrin alpha2, alpha3, betal, c-erbB-2 , c-met, mst-l, autoctine motility factor and its receptor. Among these gene products. MMP-7, integrin alpha2, alpha3, beta1, and c-erbB-2 are expressed in a large amount, as the metastatic potential increases. In the in vitro experiments, anti integrin antibodies against integrin alpha2, alpha3, beta1 inhibited the adhesion and invasion abilities of this cell line. Furthermore, when 1O^7 cells of this cell line after treatment of anti-integrin monoclonal antibody for 48 hours were intraperitoneally inoculated in nude mice, the survival of mice of Mab treated group was significantly longer than that of non treated group.Antisense oligonucleotides of 16 mer DNA containing initiation codon of AUG of c-met, and AMFR mRNA completely suppressed the invasion ability of MKN-45-P through Matrigel coated chamber. Furthermore, antisense oligonucleotides against MMP-7 was tried whether this S-oligo. can inhibit the invasion and proliferation activity of MKN-45-P or not. Even by treating 10 muM of the antisense DNA for 48 hours, proliferative activity of MKN-45-P was not suppressed. In contrast, invasion ability of MKN-45-P was completely blocked by this antisense DNA.However, antisense DNA against MMP-7 did not improve the survival of nude mice bearing MKN-45-P, inoculated intraperitoneally.MKN-45-P also expressed c-ets -l gene, and this gene product (Ets-l) is a transcription factor of several metastasis associated genes, such as MMP-l, -3, -9, MTl-MMP, urokinase, integrin subunites, and c-erbB-2. By treatment of MKN-45-P with antisense DNA against c-ets -l mRNA, expressions of urokinase, MMP-l , integrin a2, cx.3 and MMP-7 were dramatically reduced. As a results, adhesion and invasion ability of MKN-45-P were completely inhibited after treatment of antisense DNA agains c-ets -l mRNA.In addition, the antisense DNA improved the survival of nude mice bearing intraperitoneal MKN45-P.From these results, this highly metastatic cell line acquires the overexpression of multiple metastasis related genes, such as adhesion molecules, motility factors and matrix digesting enzymes. The control of c-ets-1 gene may suppress several metastasis related genes simultaneously , and the strategy to control c-ets-I mRNA may be a hopeful one to treat peritoneal dissemination.研究課題/領域番号:09671291, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：研究課題「ヒト胃癌の腹膜播種のモデルの確立とその応用 」課題番号09671291（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-09671291/096712911998kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

Disposition Kinetics of Taxanes in Peritoneal Dissemination

Treatment of cancers in the abdominal cavity, such as peritoneal dissemination, is difficult, but in principle intraperitoneal administration of anticancer drugs is expected to be preferable to systemic administration. Taxane anticancer drugs are used to treat gastric cancer patients with peritoneal dissemination. They are administered as micellar preparations, Taxol and Taxotere, which consist of paclitaxel in Cremophor EL (crEL) and docetaxel in Polysorbate-80 (PS-80), respectively. In this paper we review the disposition kinetics of taxane anticancer drugs after intraperitoneal administration in peritoneal dissemination patients and animal models and also discuss the effect of the surfactant vehicle on the behavior of taxanes

Primary retroperitoneal mullerian adenocarcinoma

Mullerian tumors are extremely rare malignancies in the retroperitoneum. We report a case of a 46-year old woman who presented with an eight year history of lower abdominal mass. Ultrasonography (US) and computed tomography (CT) demonstrated a 15×10 cm cystic mass in the left lower retroperitoneum. As serial percutaneous needle aspiration cytology was negative for malignancy, she was observed for seven years. Eleven months ago, the mass was excised. The histopathology was reported as mucinous adenocarcinoma of the retroperitoneum. Six cycles of intraperitoneal (IP) chemotherapy was administered during the last six months after diagnosis of recurrence by aspiration cytology and high serum tumor markers (CEA, CA19-9). A few days ago, positron emission tomographic (PET) scanning showed evidence of local recurrence and single vertebral metastasis, so she was admitted again for systemic chemotherapy. Meticulous revision of additional sections of the tumor revealed papillary, serous, mucinous, and endometrioid subtypes of the mullerian adenocarcinoma. To our knowledge, there has been no similar case described in the literature

Cytoreductive surgery plus hyperthermic intraperitoneal chemotherapy improves survival of gastric cancer with peritoneal carcinomatosis: evidence from an experimental study

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Cytoreductive surgery (CRS) plus hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) has been considered as a promising treatment modality for gastric cancer with peritoneal carcinomatosis (PC). However, there have also been many debates regarding the efficacy and safety of this new approach. Results from experimental animal model study could help provide reliable information. This study was to investigate the safety and efficacy of CRS + HIPEC to treat gastric cancer with PC in a rabbit model.</p> <p>Methods</p> <p>VX2 tumor cells were injected into the gastric submucosa of 42 male New Zealand rabbits using a laparotomic implantation technique, to construct rabbit model of gastric cancer with PC. The rabbits were randomized into control group (n = 14), CRS alone group (n = 14) and CRS + HIPEC group (n = 14). The control group was observed for natural course of disease progression. Treatments were started on day 9 after tumor cells inoculation, including maximal removal of tumor nodules in CRS alone group, and maximal CRS plus heperthermic intraperitoneal chemoperfusion with docetaxel (10 mg/rabbit) and carboplatin (40 mg/rabbit) at 42.0 ± 0.5°C for 30 min in CRS + HIPEC group. The primary endpoint was overall survival (OS). The secondary endpoints were body weight, biochemistry, major organ functions and serious adverse events (SAE).</p> <p>Results</p> <p>Rabbit model of gastric cancer with PC was successfully established in all animals. The clinicopathological features of the model were similar to human gastric PC. The median OS was 24.0 d (95% confidence interval 21.8 - 26.2 d ) in the control group, 25.0 d (95% CI 21.3 - 28.7 d ) in CRS group, and 40.0 d (95% CI 34.6 - 45.4 d ) in CRS + HIPEC group (<it>P </it>= 0.00, log rank test). Compared with CRS only or control group, CRS + HIPEC could extend the OS by at least 15 d (60%). At the baseline, on the day of surgery and on day 8 after surgery, the peripheral blood cells counts, liver and kidney functions, and biochemistry parameters were all comparable. SAE occurred in 0 animal in control group, 2 animals in CRS alone group including 1 animal death due to anesthesia overdose and another death due to postoperative hemorrhage, and 3 animals in CRS + HIPEC group including 1 animal death due to anesthesia overdose, and 2 animal deaths due to diarrhea 23 and 27 d after operation.</p> <p>Conclusions</p> <p>In this rabbit model of gastric cancer with PC, CRS alone could not bring benefit while CRS + HIPEC with docetaxel and carboplatin could significantly prolong the survival with acceptable safety.</p

Laparoscopic Diagnosis and Laparoscopic Hyperthermic Intraoperative Intraperitoneal Chemotherapy for Pseudomyxoma Peritonei Detected by CT Examination

Background. Patients with early stage of pseudomyxoma peritonei (PMP) are sometimes difficult to diagnose the primary sites and intraperitoneal spread of tumor and to perform a cytological study. Methods. Patients without a definitive diagnosis and with unknown extent of peritoneal spread of tumor underwent laparoscopy. Hyperthermic intraoperative intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) was administered as part of the same intervention. The results of treatment were evaluated at the time of second-look laparotomy (SLL) as a subsequent intervention. Results. Eleven patients were managed by diagnostic laparoscopy followed by laparoscopic HIPEC (LHIPEC). The operation time of laparoscopic examination and LHIPEC was 177 ± 26 min (range 124–261 min). No intraoperative complication was experienced. The peritoneal carcinomatosis index (PCI) score by laparoscopic observation was 16.5 ± 6.4 (range 0–30). One patient with localized pseudomyxoma peritonei (PMP) mucocele did not received LHIPEC; the other 10 patients with peritoneal metastases (PM) were treated with LHIPEC. After LHIPEC, ascites disappeared in 2 cases and decreased in the amount in the other 8 cases. Nine patients underwent SLL and cytoreductive surgery (CRS) combined with HIPEC. The duration between LHIPEC and SLL ranged from 40 to 207 days (97 ± 40 days). The PCI at the SLL ranged from 4 to 27 (12.9 ± 7.1). The PCI at the time of SLL decreased as compared to PCI at the time of diagnostic laparotomy in 7 of 9 patients. Median follow-up period is 22 months (range 7–35). All 11 patients are alive. Conclusion. The early results suggest that laparoscopic diagnosis combined with LHIPEC is useful to determine the surgical treatment plan and reduce the tumor burden before definitive CRS at SLL

Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells

Anterior pituitary is critical for endocrine systems. Its hormonal responses to positive and negative regulators are indispensable for homeostasis. For this reason, generating human anterior pituitary tissue that retains regulatory hormonal control in vitro is an important step for the development of cell transplantation therapy for pituitary diseases. Here we achieve this by recapitulating mouse pituitary development using human embryonic stem cells. We find that anterior pituitary self-forms in vitro following the co-induction of hypothalamic and oral ectoderm. The juxtaposition of these tissues facilitated the formation of pituitary placode, which subsequently differentiated into pituitary hormone-producing cells. They responded normally to both releasing and feedback signals. In addition, after transplantation into hypopituitary mice, the in vitro-generated corticotrophs rescued physical activity levels and survival of the hosts. Thus, we report a useful methodology for the production of regulator-responsive human pituitary tissue that may benefit future studies in regenerative medicine