Функция ионных каналов эпителиальных клеток при муковисцидозе

Cystic fibrosis is a systemic hereditary disease caused by mutations in the CFTR gene, which regulates the transport of electrolytes (mainly chloride) across the membranes of the epithelial cells that line excretory ducts of exocrine glands. Dysfunction of the CFTR protein reduces passage of chloride ions through cell membranes and disrupts the passage of sodium ions, bicarbonate ions, and water.The aim of the study was to analyze comprehensively functioning of chloride and alternative (sodium and calcium) channels in the epithelium of patients with cystic fibrosis in relation to the age using functional tests in vitro.Methods. We used data from medical histories of patients with cystic fibrosis and intestinal current measurements.Results. The function of the calcium channel decreased with age in people without cystic fibrosis and carriers of “severe” genotypes. The function of sodium, chloride, and calcium channels was lower in all age groups of patients with cystic fibrosis compared to controls (p < 0.05). When comparing groups of patients with “severe genotype” and “mild genotype”, statistically significant differences were found in response to forskolin (p < 0.05). Patients with “mild” genotypes had a residual function of the CFTR channel which decreased with age.Conclusion. For the first time, the functioning of chloride and alternative channels in cystic fibrosis have been described in relation to the age and the genotype of patients.Муковисцидоз (МВ) – системное наследственное заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR, который регулирует транспорт электролитов (главным образом хлора) через мембраны эпителиальных клеток, выстилающих выводные протоки экзокринных желез. Нарушение функции белка CFTR приводит к снижению пассажа ионов хлора через мембраны клеток и нарушению пассажа ионов натрия, бикарбонат-ионов, воды.Целью исследования явилось комплексное изучение функционирования хлорного и альтернативных (натриевых и кальциевых) каналов эпителия у пациентов с МВ в возрастном аспекте с использованием функциональных тестов in vitro.Материалы и методы. Использованы данные историй болезни пациентов с МВ и метод определения разницы кишечных потенциалов.Результаты. Установлено, что с возрастом снижается функция кальциевого канала у людей без МВ и носителей «тяжелых» генотипов при МВ. Функция натриевого, хлорного, кальциевого каналов ниже во всех возрастных группах у пациентов с МВ по сравнению с таковой у лиц контрольной группы (р < 0,05). При сравнении групп пациентов с «тяжелым» и «мягким» генотипами выявлены статистически значимые различия в ответ на применение форсколина (р < 0,05), при «мягких» генотипах действует остаточная функция CFTR-канала, которая снижается с возрастом.Заключение. Впервые описаны особенности функционирования хлорного и альтернативных каналов в возрастном аспекте при МВ с учетом генотипа пациентов

Ассоциации гена VDR с клиническими проявлениями и осложнениями муковисцидоза

Cystic fibrosis (CF) is the most common severe autosomal recessive disease in the Caucasoid population caused by mutations in the CF transmembrane regulator (CFTR) gene. However, the course of the disease may be modulated by genetic factors other than the CFTR gene and may be pleiotropically influenced by VDR (Vitamin D Receptor) gene. The aim of the study was to search for associations between genetic variants (c.1206T>C(A>G), c.152T>C, c.1174+283G>A) of VDR gene and clinically significant manifestations of CF, complications, and responses to therapy. Methods. Patients with CF (n = 283) and healthy children (n = 333), who formed the control group, were examined. Calcidiol levels were tested in all subjects. Polymorphic variants of VDR gene (c.1206T>C(A>G), c.152T>C, c.1174+283G>A) were tested by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. Results. It was found that carriers of the TT genotype of the c.152T>C FokI variant of VDR gene are 6.3 times more likely to develop meconium ileus (odds ratio – OR – 6.375; p = 0.011), 3.2 times more likely – respiratory failure (OR – 3.253; p = 0.079), 3.4 times more likely – chronic lung infection (CIL) caused by Pseudomonas aeruginosa (OR – 3.432; p = 0.026), and 4 times more likely – CIL caused by non-fermenting gram-negative bacteria (OR – 4.056; p = 0.009). Carriers of the CC genotype of the c.1206T>C(A>G) TaqI genetic variant use systemic corticosteroids more frequently (66% vs 7%) (OR – 0.034; p = 0.001). It was shown that the AA genotype of the BsmlI polymorphism (c.1174 + 283G>A) is 4 times more likely to be detected in children with CF-associated liver diseases (OR – 4.300; p = 0.051). Conclusion. The contribution of all studied genetic variants c.1206T>C(A>G) TaqI, c.152T>C FokI, BsmlI (c.1174+283G>A) of the VDR gene to the clinical manifestations, complications and response to therapy in CF is described.Муковисцидоз (МВ), или кистозный фиброз, является наиболее частым тяжелым аутосомно-рецессивным заболеванием в европеоидной популяции, вызываемым мутациями гена трансмембранного регулятора МВ (CFTR). Однако течение заболевания может модулироваться генетическими факторами, отличными от гена CFTR, и подвергаться плейотропному влиянию гена VDR (Vitamin D Receptor – рецептор к витамину D). Целью исследования явился поиск ассоциаций между генетическими вариантами (c.1206T>C(A>G), c.152T>C, c.1174+283G>A) гена VDR и клинически значимыми проявлениями МВ, осложнениями и ответами на терапию. Материалы и методы. Обследованы пациенты с МВ (n = 283) и здоровые дети (n = 333), составившие контрольную группу. У всех обследованных определялось содержание кальцидиола. Тестирование полиморфных вариантов гена VDR (c.1206T>C(A>G), c.152T>C, c.1174+283G>A) проводилось методами полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Результаты. Выявлено, что у носителей генотипа ТТ генетического варианта c.152T>C FokI гена VDR в 6,3 раза чаще реализуется мекониевый илеус (отношение шансов (Odds Ratio – OR) – 6,375; p = 0,011), в 3,2 раза чаще – дыхательная недостаточность (OR – 3,253; p = 0,079), в 3,4 раза чаще – хроническая инфекция легких (ХИЛ), вызванная Pseudomonas аeruginosa (OR – 3,432; p = 0,026), в 4 раза чаще – ХИЛ, вызванная неферментирующими грамотрицательными бактериями (OR – 4,056; p = 0,009). У носителей генотипа СС генетического варианта c.1206T>C(A>G) TaqI чаще (66 % vs 7 %) применяются системные глюкокортикостероиды (OR – 0,034; p = 0,001). Показано, что генотип АА полиморфизма BsmlI (c.1174+283G>A) в 4 раза чаще выявляется у детей с МВ-ассоциированными заболеваниями печени (OR – 4,300; p = 0,051). Заключение. Показан вклад всех изучаемых генетических вариантов c.1206T>C(A>G) TaqI, c.152T>C FokI, BsmlI (c.1174+283G>A) гена VDR в формирование клинических проявлений, осложнений и ответа на терапию при МВ

Использование функциональных тестов для оценки остаточной активности канала CFTR и индивидуального подбора эффективных CFTR-модуляторов для лечения пациентов с муковисцидозом с «мягким» и «тяжелым» генетическими вариантами

Intestinal current measurement (ICM) and forskolin-induced swelling (FIS) assay in human intestinal organoids from rectal biopsies of cystic fibrosis (CF) patients are the new functional tests for assessment of CFTR channel activity that are widely used in the leading laboratories worldwide for scientific and clinical studies.The aim of the study was to assess the use of the new functional tests in adult CF patients with identified N1303K and R334W CFTR gene variants.Methods. Rectal suction biopsies were obtained from the two CF patients aged 36 and 27 years with N1303K/3821delT and R334W/F508del CFTR mutations, respectively. Results of the ICM and FIS assay in intestinal organoids were compared to the clinical data.Results. ICM has demonstrated that R334W is a ‘mild’ genetic variant with high residual CFTR channel activity. At the same time, N1303K is a ‘severe’ genetic variant and leads to a severe loss of CFTR channel function. These findings correlate with the clinical data. CFTR modulators compensate for the reduced activity of the R334W CFTR variant, as shown by the FIS assay. But there was a limited response of the forskolin-stimulated organoids to VX-770 potentiator and VX-809 corrector in the cells with N1303K genetic variant.Conclusion. ICM and FIS assay in human intestinal organoids are reliable methods for quantification of CFTR channel activity. They can also predict the efficacy of the targeted therapy in CF patients in vivo.Новые функциональные методы исследования активности канала CFTR – определение разности кишечных потенциалов (ОРКП) и форсколиновый тест на кишечных органоидах, получаемых из ректальных биоптатов больных муковисцидозом (МВ), приняты в ведущих лабораториях мира для научной и клинической работы.Целью исследования явилась оценка возможности применения новейших функциональных методик у взрослых больных МВ – носителей генетических вариантов гена CFTR – N1303K и R334W.Материалы и методы. Получены ректальные биоптаты у пациенток с МВ (n = 2) в возрасте 36 и 27 лет с генотипом CFTR R334W/F508del и N1303K/3821delT соответственно. Проведены ОРКП и форсколиновый тест на кишечных органоидах; полученные результаты сопоставлены с клиническими данными.Результаты. По результатам ОРКП подтверждено, что генетический вариант R334W является «мягким», с сохранением высокой остаточной функциональной активности канала CFTR, тогда как генетический вариант N1303K является «тяжелым» и приводит к утрате рабочего белка CFTR, что соответствует представленной клинической картине. Результаты форсколинового теста свидетельствуют о том, что вариант R334W хорошо поддается коррекции CFTR-модуляторами. Потенциатор VX-770 и корректор VX-809 оказывают слабое действие на стимуляцию форсколином органоидов при генетическом варианте N1303K.Заключение. Использование метода ОРКП и форсколинового теста на кишечных органоидах позволяет количественно оценить работу белка CFTR и in vitro определить эффективность таргетной терапии у пациентов с МВ

Подбор CFTR-модуляторов для детей – носителей генетического варианта W1282R

Objective. To study the clinical manifestations of W1282R variant, functional activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) channel, and effectiveness of CFTR modulator therapy in patients with the W1282R variant. Materials and methods included medical records, intestinal current measurement method (ICM) and method of intestinal organoids (IO). Results. The c.3844T>C (p.Trp1282Arg, W1282R) variant refers to missense mutations. The Cystic Fibrosis (CF) Patient Registry of the Russian Federation (2019) provides the data on 34 patients with the W1282R variant in the genotype. Clinical manifestations in two patients with the W1282R variant corresponds to the severe course of CF. ICM method revealed the loss of CFTR function. The effect of VX-809 corrector, VX-770 potentiator and their combined use were assessed in each patient using the method of IO. Conclusion. The results indicated a “severe” W1282R variant. The application of VX-809 corrector had no effect on the restoration of chloride channel function, unlike the F508del homozygous control sample (class II mutations). The VX-770 potentiator had no effect on the kinetic properties of CFTR protein. But in both patients, a significant restoration of lost channel function (~45%) was recorded with the combined use of VX-809 corrector and VX-770 potentiator, which is typical for class III and class IV variants. This challenges the conclusions that the W1282R variant has class II characteristics only. Combination therapy with VX-809 and VX-770 may be recommended for patients with the W1282R/CFTRdel2,3 and W1282R/F508del genotypes

Состояние здоровья близнецов с генотипом F508del/R334W при муковисцидозе и возможности таргетной терапии

The CFTR gene contains 27 exons and is located at position 31.1 of the long arm of chromosome 7 (7q31.1). More than 2000 variants of the CFTR gene have been described so far. The R334W variant is associated with the mild disease course. Objective. To perform comprehensive assessment of the health status, functional CFTR activity, and efficacy of CFTR modulators in twins with the F508del/R334W genotype. Materials and methods. Data from medical records, intestinal current measurement (ICM), intestinal organoid culture. Results. We examined two twins with moderate cystic fibrosis who had similar clinical manifestations, including rhinosinusitis with nasal polyps and respiratory infections caused by gram-negative bacteria. Both patients also had polyvalent allergy. One child presented with a decrease of pancreatic elastase 1 in stool from 500 µg/g to 125 500 µg/g, which required administration of pancreatin and dosage increase later. Both children had reduced chloride channel function as demonstrated by ICM. The administration of a corrector (VX-809) and a potentiator (VX-770) effectively restored the channel function; their simultaneous use ensured an additive effect. The quantitative results obtained in both cultures of intestinal organoids were very similar

Клинико-генетическая характеристика редких патогенных вариантов в гене CFTR у российских больных муковисцидозом

The variety of clinical manifestations of cystic fibrosis is driven by the diversity of the CFTR gene nucleotide sequence. Descriptions of the clinical manifestations in patients with the newly identified genetic variants are of particular interest.The aim of this study was to describe clinical manifestations of the disease with the newly identified genetic variants.Methods. Data from Registry of patients with cystic fibrosis in the Russian Federation (2018) were used. The data review included three steps — the search for frequent mutations, Sanger sequencing, and the search for extensive rearrangements by MLPA. 38 pathogenic variants were identified that were not previously described in the international CFTR2 database. We selected and analyzed full case histories of 15 patients with 10 of those 38 pathogenic variants: p.Tyr84*, G1047S, 3321delG, c.583delC, CFTRdele13,14del18, CFTRdele19-22, c.2619+1G>A, c.743+2T>A, p.Glu1433Gly, and CFTRdel4-8del10-11.Results. A nonsense variant p.Tyr84* was found in 5 patients (0.08 %). Two missense variants c.3139G>A were found in 2 siblings (0.03 %). The c.4298A>G was found in 1 patient. Other variants were detected in a single patient (0.02 %) each. They included two variants of a deletion with a shift of the reading frame 3321delG and c.583delC, two splicing disorders c.2619+1G>A and c.743+2T>A, three extended rearrangements CFTRdele19-22, CFTRdele13,14del18, and CFTRdel4-8del10-11. The last two variants include 2 rearrangements on one allele, which cause the severe course in two young children. 8 of the 10 variants are accompanied by pancreatic insufficiency (PI). Among patients with p.Tyr84*, one had ABPA, one had liver transplantation, and all had Pseudomonas aeruginosa infection. Nasal polyps were diagnosed in 2 patients with p.Tyr84*, 1 with G1047S, 1 with CFTRdel4-8del10-11, and 1 patient with 3321delG, who also had osteoporosis and cystic fibrosis-related diabetes (CFRD). 2 patients with PI with 3321delG and CFTRdel4-8del10-11 genetic variants, and 1 with PI with p.Glu1433Gly genetic variant had severe protein-energy malnutrition (PEM).Conclusion. Clinical manifestations of previously undescribed CFTR genetic variants were described. 5/10 genetic variants should be attributed to class I, 3/10 – to class 7 of the function classification of pathogenic CFTR gene variants associated with transcription and translation disruptions. Class of the identified missense variants c.3139G>A and c.4298A>G has not been established and requires further functional, cultural, and molecular genetic studies.Многообразие клинических проявлений муковисцидоза (МВ) обусловлено различными вариантами гена CFTR. Описание клинических проявлений впервые выявленных генетических вариантов представляет особый интерес.Целью исследования явилось описание клинических проявлений при впервые выявленных генетических вариантах гена CFTR.Материалы и методы. Использовались данные Регистра больных МВ (2018). Проводилось трехэтапное обследование – поиск частых мутаций, секвенирование по Сэнгеру, поиск обширных перестроек. Из неописанных генетических вариантов (n = 38) выбраны пациенты (n = 15) с 10 неописанными вариантами гена CFTR. Проведен анализ историй болезни за весь период течения МВ у пациентов, в генотипе которых выявлены p.Tyr84*, G1047S, 3321delG, c.583delC, CFTRdele13,14del18, CFTRdele19-22, c.2619+1G>A, c.743+2T>A, p.Glu1433Gly, CFTRdel4-8del10-11.Результаты. Выявлены нонсенс-вариант p.Tyr84* у 5 (0,08 %) пациентов, 2 миссенс-варианта c.3139G>A – у 2 (0,03 %) сибсов и c.4298A>G – у 1 пациента; остальные варианты выявлены однократно (0,02 %); 2 делеции со сдвигом рамки считывания 3321delG и c.583delC; 2 варианта нарушения сплайсинга c.2619+1G>A, c.743+2T>A; 3 протяженных перестройки CFTRdele19-22, CFTRdele13,14del18, CFTRdel4-8;del10-11. Последние 2 варианта включают 2 перестройки на 1-м аллеле, что обусловливает тяжелое течение у детей (n = 2) раннего возраста, у 8 из 10 отмечена панкреатическая недостаточность. Один из пациентов с p.Tyr84* наблюдался с аллергическим бронхолегочным аспергиллезом, 1 перенес трансплантацию печени. В 100 % случаев обнаружена синегнойная инфекция. Полипоз носа диагностирован у 2 пациентов с p.Tyr84*, по 1 – с G1047S, CFTRdel4-8; del10-11 и с 3321delG, у этого же больного выявлен остеопороз и муковисцидоз-зависимый сахарный диабет. Белково-энергетическая недостаточность установлена у 2 пациентов с панкреатической недостаточностью 3321delG и CFTRdel4-8del10-11 и у одного – с сохранной функцией поджелудочной железы с p.Glu1433Gly.Заключение. Представлено описание клинической картины ранее не описанных вариантов гена CFTR. По функциональной классификации гена CFTR к I классу относятся 5 из 10 описываемых генетических вариантов, к VII классу, при котором нарушаются процессы транскрипции и трансляции белка, – 3 варианта. Класс выявленных миссенс-вариантов c.3139G>A и c.4298A>G не установлен. Отмечена необходимость дальнейших исследований с помощью функциональных, культуральных и молекулярно-генетических методов

Описание редких аллелей гена CFTR при муковисцидозе с помощью функциональных тестов и форсколинового теста на ректальных органоидах

Cystic fibrosis (CF) is a systemic hereditary disease caused by a mutation of the CFTR gene and characterized by damage to the glands of external secretion and severe dysfunctions of the respiratory system. The “severe” genotypes are associated with more pronounced and early clinical manifestations. The “mild” genotypes are associated with a delayed onset of clinical manifestations.Methods. An analysis of the medical history of patients with asymptomatic CF from the Russian CF centers was carried out. Rectal biopsy specimens were used for intestinal current measurement (ICM) and forskolin-induced swelling assay in intestinal organoids. DNA for sequencing was isolated from the venous blood leukocytes.Results. 2 CF patients with genotypes F508del/c.1584+18672A>G (patient 1, 12 years old) and F508del/G509D-E217G (patient 2, 3 years old) were examined. The diagnosis was based on neonatal screening. The ICM assay showed a reduced function of the CFTR channel: ΔISC for forskolin was 12.33 ± 2.35 μA/cm2 in patient 1 and 25 ± 3.37 μA/cm2 in patient 2. The negative response to carbachol and histamine reflects the entry of potassium ions into the cells, which is typical for CF. The assay in intestinal organoids showed that the amount of functional protein on the apical membrane of the intestinal epithelium increases both under the action of the potentiator and the corrector in both patients. The greatest effect is observed when the VX-770 and VX-809 are used together.Conclusion. The ICM functional assay and the forskolin-induced swelling assay in intestinal organoids are sensitive enough to determine the residual functional activity of the CFTR channel and clarify the diagnosis in difficult cases. The studied genetic variants c.1584+18672A>G and G509D-E217G belong to class IV – VI mutations. The clinical picture corresponds to the manifestations of “mild” mutations. The studied patients still attend the Russian cystic fibrosis centers.Муковисцидоз (МВ) – системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR и характеризующееся поражением желез внешней секреции, тяжелыми нарушениями функций органов дыхания. Считается, что при «тяжелом» генотипе клинические про- явления более выражены и рано манифестируют. При «мягких» генотипах старт клинических проявлений может быть отсрочен.Материалы и методы. Проведен анализ историй болезни пациентов (n = 2) с МВ без клинических проявлений, наблюдаемых в российских центрах МВ. Для определения разности кишечных потенциалов (ОРКП) и форсколинового теста на кишечных органоидах использовался биопсийный материал прямой кишки. ДНК для секвенирования выделялась из лейкоцитов венозной крови.Результаты. При обследовании у 1-й пациентки (девочка 12 лет) установлен генотип F508del/c.1584+18672A>G, у 2-го (мальчик 3 лет) – F508del/G509D-E217G. Диагноз установлен на основании неонатального скрининга. Методом ОРКП выявлена сниженная функция CFTR-канала (плотность тока короткого замыкания (ΔISC) на форсколин у 1-й пациентки – 12,33 ± 2,35, у 2-го пациента – 25,00 ± 3,37 μA / см2, ответ на карбахол и гистамин в отрицательную сторону отражает вход ионов калия в клетки, что характерно для МВ. По данным форсколинового теста на кишечных органоидах показано, что количество функционального белка на апикальной мембране кишечного эпителия увеличивается при действии как потенциатора, так и корректора у обоих пациентов. Наибольший эффект наблюдается при совместном применении потенциатора VX-770 и корректора VX-809.Заключение. Функциональный тест ОРКП и форсколиновый тест на кишечных органоидах являются чувствительными методами определения остаточной функциональной активности канала CFTR и позволяют уточнить диагноз в сложных случаях. Изученные генетические варианты c.1584+18672A>G и G509D-E217G относятся к мутациям IV–VI класса, клиническая картина соответствует проявлениям «мягких» мутаций. Пациенты продолжают наблюдаться в российских центрах МВ