Selection of high-affinity RNAs for the Alzheimer´s beta-amyloid

Titel, Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung > 1.1 Morbus Alzheimer > > 1.2 RNA > > 1.3 In vitro-Selektion > > 1.4 Stabilisierung von RNA > > 1.5 Vergleich von Aptameren und Antikörpern 2 Aufgabenstellung 3 Methoden > 3.1 Chemische Nukleinsäuresynthese > 3.2 Aufreinigung von Nukleinsäuren > 3.3 Molekularbiologische Methoden > 3.4 Vorbereitung der Affinitätschromatographie > 3.5 Mikrobiologische Methoden > 3.6 Charakterisierung der Aptamere 4 Ergebnisse > 4.1 Immobilisierung der Peptide > > 4.2 In vitro-Selektion > > 4.3 Charakterisierung der Aptamere 5 Diskussion 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis Anhang > A Geräte, Enzyme und Chemikalien > > B Puffer und Medien > > C Lebenslauf > > D Eigene PublikationenDie Ursache der Alzheimer-Krankheit ist immer noch unbekannt, jedoch ist sie nach dem derzeitigen Kenntnisstand eng verknüpft mit der Ablagerung des Amyloid-Peptids im Gehirn der Patienten. Daher spielt das Amyloid bei der Suche nach Medikamenten und Diagnostika eine entscheidende Rolle. Durch Einsatz der RNA-Technologien sollte mit dieser Arbeit ein Hilfsmittel für die weitere Untersuchung der Alzheimer-Krankheit zur Verfügung gestellt werden. Die in vitro-Selektion erlaubt das Design von spezifischen Nukleinsäuren gegen fast jedes Zielmolekül. Damit ist zu den Antikörpern eine neue Stoffklasse getreten, mit der man einige Probleme der Antikörper umgehen kann. Vor allem die chemische Synthese der Nukleinsäuren erlaubt eine maßgeschneiderte Modifizierung wie z. B. den Einbau von Reportermolekülen, wodurch sie sich hervorragend eignen für analytische und diagnostische Aufgaben. Da eine Veränderung des Amyloid-Gehalts im Blut von Alzheimer-Patienten beschrieben wurde, wäre ein Einsatz von Aptameren für eine Diagnose denkbar. Weiterhin wurden bereits Antikörper vorgestellt, die eine Aggregation des Amyloids zu den senilen Plaques verhindern kann. Auch hier wäre ein Einsatz von Aptameren vorstellbar. Mit Hilfe der Methode der in vitro-Selektion wurde aus einer kombinatorischen RNA-Bibliothek mit ca. 1015 unterschiedlichen Molekülen hochaffine RNA- Aptamere gegen das Amyloid b A4(1-40) und ein Fragment b A4(1-16) isoliert. Dazu wurde eine DNA-Bibliothek mit 70 randomisierten Nukleotiden chemisch synthetisiert und für die Selektion in RNA transkribiert. Nach 8 Selektionszyklen, bestehend aus Selektion und Amplifikation, konnten affine Moleküle isoliert werden. Die apparenten Dissoziationskonstanten dieser Aptamere liegen bei 29-48 nM für das lange Peptid bzw. 758 nM für das kurze b A4(1-16) Fragment. Die für das Amyloid erhaltenen Aptamere liegen in dem Bereich der besten für Peptide bisher isolierten Aptamere, während für kleinere, flexiblere Peptide häufig Aptamere im mikromolaren Bereich beschrieben wurden. In dieser Arbeit wurden Wege zu neuen Hilfsmitteln für die Untersuchung und Diagnose der Alzheimer-Krankheit vorgestellt. Nun sollten diese Aptamere auf ihre Wirksamkeit überprüft werden, um dann eine Verkürzung der Sequenzen und eine Modifizierung der RNA zur Stabilisierung gegenüber RNasen anzuschließen.Although the cause of the Alzheimer´s disease is still unknown, it is supposed to be closely related with the deposition of amyloid peptides in the brain of patients. The amyloid is thus a major target in the search for novel diagnostics and therapeutic approaches. This work employs RNA-technologies to develop new tools for the study of the Alzheimer´s disease. The in vitro selection enables the design of specific nucleic acids (aptamers) against almost any target molecule. The aptamers have similar properties as monoclonal antibodies, but several advantages. The chemical synthesis of these nucleic acids enables tailor-made modifications. By introduction of specific reporter groups these RNAs become suitable tools for analytical and diagnostic purposes. Since a change of the amyloid concentration has been reported in the blood of Alzheimer´s disease patients, the use of amyloid-specific aptamers for diagnosing the disease seems conceivable. Moreover, antibodies have been reported that prevent the aggregation of amyloid into senile plaques. This points towards a potential therapeutic application of the amyloid-specific aptamers. High affinity RNA aptamers against the b A4(1-40) and a fragment b A4(1-16) were isolated from a combinatorial library of 1015 different molecules by using in vitro selection. For this purpose a DNA library containing 70 randomised nucleotides was chemically synthesised and transcribed into RNA. Affinic molecules were isolated after 8 rounds of selection and amplification. The apparent dissociation constants of these aptamers were 29-48 nM for the long peptide and 758 nM for the short b A4(1-16) fragment. The binding constants for the aptamers against the amyloid are within the range of the highest affinities so far described for peptide-specific aptamers. This work introduces a new approach for the study and diagnosis of the Alzheimer´s disease. In future experiments, the efficacy of the aptamers needs to be tested. In addition, identifying the minimal binding motifs and enhancing the stability of the aptamers against RNase degradation are necessary steps to render these aptamers into reliable tools