Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека

The aim of this work was to test modifications of the standard protocol for the sample preparation of cell/tissue lysate before performing the affinity isolation of lysate protein partners for the target protein (bait protein) which is covalently immobilized on an inert sorbent (e.g. BrCN-, SH-Sepharose 4B) or a carrier (e.g. paramagnetic nanoparticles). The series of our previous works on applying the approach to direct molecular fishing procedure with combination of affinity chromatography and LC-MS/MS analysis using a number of proteins, encoded by the genes of human chromosome 18, have shown that there are at least two problems affecting the specificity and the effectiveness of this procedure. These include: (i) redundancy of the background proteins in the eluates from an affinity sorbent (carrier) due to isolation of multiprotein complexes “labeled” with a direct protein partner which binds with a bait protein immobilized on the sorbent; (ii) low enrichment of the eluates with appropriate protein partners due to the fact that some direct protein partners in the lysate exist in stable “wild type” complexes with the bait protein itself. This means that latter group of protein partners will not be sufficiently isolated from lysate. Therefore, in order to increase the specificity and efficiency of affinity isolation of protein partners for the bait protein, we modified the standard protocol of lysate preparation and the preliminary step on dissociation of lysate protein complexes was added. Several model experiments for the choice of regeneration solution, assessment of their efficiency in the dissociation of lysate protein complexes as well as the stability and binding capacity of proteins were performed under the control of surface plasmon resonance (SPR) biosensor Biacore 3000 using HepG2 cell lysate. It was shown that acid treatment and incubation of the cell lysate for one min on ice (final lysate dilution 20 times) and subsequent neutralization (pH shift from 2.0 to 7.4) resulted in maximal dissociation of the lysate protein complexes without significant negative effects on the protein-protein interactions tested.Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия

ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВНУТРИАРТЕРИАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СРЕДЫ, ПОЛУЧЕННОЙ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИЦ, ПРИ ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ У КРЫС

Transplantation of various types of stem cells as a possible therapy for stroke has been tested for years and the results are promising. Recently, most researchers are inclined to assume that the therapeutic effect of stem cell therapy is based on the mechanism of paracrine action associated with the secretion wide set of regulatory proteins. The aim of this study was to evaluate therapeutic effects of iPSC-derived glial progenitor cells conditioned medium in the rat middle cerebral artery occlusion model of the ischemic stroke. We showed that intra-arterial administration of glial progenitor cells conditioned medium promoted faster decrease of neurological deficit compared to the control group. Moreover, expression of gap43, bax, and tnfa genes involved in neuritogenesis, apoptosis and neuroinflammation was altered. However, no significant enhanced reduction of the infarct volume was registered. Our results demonstrated that administration of glial progenitor cells conditioned medium induced functional recovery after experimental stroke and may affect brain plasticity. © 2020, Human Stem Cell Institute. All rights reserved.На сегодняшний день перспективным подходом к терапии ишемического инсульта является трансплантация различных типов стволовых клеток, результаты которой продемонстрировали свою эффективность. В последнее время большинство исследователей склоняются к предположению, что терапевтический эффект клеточной терапии в большей степени основан на механизме паракринного действия, связанного с секрецией клетками широкого набора регуляторных белков. Недавние исследования показали, что введение кондиционированных сред, полученных при культивировании стволовых клеток, может быть эффективным при терапии заболеваний центральной нервной системы. Целью настоящей работы является оценка терапевтических эффектов кондиционированной среды, содержащей продукты секреции глиальных клеток-предшественниц, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, на модели экспериментального ишемического инсульта у крыс. Было обнаружено, что внутриартериальное введение кондиционированной среды, полученной при культивировании глиальных клеток-предшественниц, способствовало более быстрому снижению степени неврологического дефицита по сравнению с контрольной группой. Кроме того, были выявлены изменения в экспрессии генов gap43, bax и tnfa. однако значимого уменьшения объема очага инфаркта зарегистрировано не было. Наши результаты показали, что введение кондиционированной среды, содержащей продукты секреции глиальных клеток-предшественниц, индуцирует функциональное восстановление и может повлиять на пластичность мозга после экспериментального инсульта

The first Russian consensus on quantitative assessment of treatment outcome

The first Russian Consensus on the quantitative evaluation of treatment results was approved by the XIII National Congress of therapists (Moscow, November 21-23, 2018). © 2019, Stavropol State Medical University. All rights reserved

ПЕРВЫЙ РОССИЙСКИЙ КОНСЕНСУС ПО КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКЕ РЕЗУЛЬТАТОВ МЕДИЦИНСКИХ ВМЕШАТЕЛЬСТВ

The first Russian Consensus on the quantitative evaluation of treatment results was approved by the XIII National Congress of therapists (Moscow, November 21-23, 2018).Первый Российский консенсус по количественной оценке результатов медицинских вмешательств одобрен XIII Национальным конгрессом терапевтов (г. Москва, 21-23 ноября 2018 года)